[发明专利]抗体的取得方法

说明书

本发明为由禽B细胞抗体库取得抗体的方法，该方法包括以下(a)～(d)工序。(a)在钙调磷酸酶抑制剂和禽血清的存在下使禽B细胞抗体库与抗原接触的工序、(b)选择工序(a)中与该抗原结合的禽B细胞的工序、(c)在钙调磷酸酶抑制剂和禽血清的存在下培养工序(b)中选择的禽B细胞的工序、和(d)取得经过工序(c)得到的禽B细胞和/或该禽B细胞表达的抗体的工序。

技术领域

本发明涉及抗体的取得方法。更具体而言，涉及由抗体库取得以高亲和性与抗原结合的抗体的方法。

背景技术

作为主成分的抗体在生物体内与特定的抗原结合，引起各种体内防御反应。抗体医药品是指利用了抗体这一特性的治疗药，因此要求治疗用抗体具有高的抗原特异性和对靶抗原的高亲和性。

抗体对抗原的亲和性大多由解离常数KD表示。通常普及的分析方法为表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)法，通过反应速度理论的(动力学)解析测量结合速度常数(ka值或kon值)和解离速度常数(kd值或koff值)而算出KD。在成为医药品的开发候选的单克隆抗体中，要求KD值为1×10^-8M以下，例如，被用作抗体医药品的Humira(注册商标)、Lucentis(注册商标)分别为具有3.0×10^-11M、4.6×10^-11M的KD的高亲和性抗体(非专利文献1、2)。

抗体制作方法通常被分类为利用动物免疫的制作方法和不利用动物免疫的制作方法。作为利用动物免疫的方法，可举出使用抗原对动物进行免疫，将得到的B细胞与骨髓瘤融合的杂交瘤法。但是该方法中存在以下等问题：由于利用了动物，因此在取得抗体之前花费时间和劳力，有时因免疫耐受而得不到抗体。作为不利用动物免疫的方法，可举出噬菌体展示法。其是向噬菌体粒子提呈由抗体的可变区域构成的单链抗体(single chainvariable fragment,scFv)，取得与靶抗原结合的克隆的方法，但是库的质量依赖于scFv的多样性，在由scFv制成完整长度抗体的过程中特异性、亲和性产生变化成为课题。

除了上述抗体制作技术，还开发了利用来源于鸡B细胞的细胞株DT40细胞的抗体制作技术ADLib(注册商标)系统，进而可利用通过基因导入而能够产生人抗体的库(专利文献1、2、3和非专利文献3)。由于可从库中选择具有与抗原特异结合的抗体的克隆，因此避免免疫耐受，可迅速得到完整长度抗体。此外，由于在禽中抗体基因序列的多样化主要是由相同转化(Gene Conversion)引起，因此具有可期待由与人、小鼠的多样化不同的机制引起的抗体基因序列的变化的优点。

为了取得高亲和性抗体已进行了一些努力，但课题众多。动物免疫中，取得了被称为多次免疫的通过重复对相同抗原进行免疫而诱导表达高亲和性抗体的B细胞的方法，但是不仅花费时间和劳力而且也存在非特异性结合增加的可能性。噬菌体展示法中，取得了将与靶抗原结合的抗体克隆的选择进行重复，将亲和性高的克隆浓缩的方法，但是即便是作为单链抗体亲和性高，然而制成完整长度抗体时亲和性也可能降低。另外，也应用了通过对各方法所取得的抗体可变区域的序列随机导入变异而取得高亲和性抗体的方法，但是存在亲和性未必会提高，即使亲和性提高但是非特异性结合上升的可能性，由于导入的变异而抗体不能正确表达·发挥功能的可能性。

此外，也开发了通过促进序列的多样化而取得高亲和性抗体的方法。例如可举出使用了与通常的野生型小鼠相比在胚中心B细胞的抗体可变区域诱发较多的体细胞突变的GANP小鼠(注册商标)的动物免疫(专利文献4)，利用了使XRCC3基因失活的禽B细胞(专利文献5)、控制AID基因的表达的禽B细胞(专利文献6)或导入提高了参与变异导入的AID的活性的变异AID的DT40-SWΔC细胞株(非专利文献4)的方法等，但是均未必直接关系到亲和性的提高。

如以上所示，抗体医药品中，高亲和性抗体的取得是非常重要的课题，期望开发更简便且高概率地取得高亲和性抗体的方法。

现有技术文献

专利文献