[发明专利]酸性α-葡萄糖苷酶变体及其用途

权利要求书

1.一种核酸分子，其编码功能性嵌合GAA蛋白，所述功能性嵌合GAA蛋白包含信号肽组成部分和功能性GAA组成部分、特别是对应于亲本GAA的截短形式的GAA组成部分，其中所述信号肽组成部分具有选自SEQ ID NO：2至4、优选为SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

2.权利要求1的核酸分子，其中所述GAA组成部分与亲本GAA多肽相比在其N-端末端处截短了1至75个连续氨基酸，其中所述GAA组成部分与亲本GAA多肽相比在其N-端末端处截短了特别是6、7、8、9、10、40、41、42、43、44、45或46个连续氨基酸，特别是与亲本GAA多肽相比在其N-端末端处截短了8、42或43个连续氨基酸。

3.权利要求1至2任一项的核酸分子，其中所述GAA组成部分与亲本GAA相比在其N-端末端处截短了8个连续氨基酸。

4.权利要求1至3任一项的核酸分子，其中所述亲本GAA是在SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：36、特别是SEQ ID NO：5中示出的人类GAA多肽。

5.权利要求1至4任一项的核酸分子，其是被优化以在体内提高所述嵌合GAA的表达和/或提高对所述嵌合GAA的免疫耐受性的核苷酸序列，特别是在SEQ ID NO：13或14中示出的核苷酸序列。

6.权利要求1至5任一项的核酸分子，其包含由下述序列的组合产生的核苷酸序列：

7.一种核酸构建物，其包含权利要求1至6任一项的核酸分子，所述核酸构建物是包含可操作连接到启动子例如优选地选自α-1抗胰蛋白酶启动子(hAAT)、甲状腺素运载蛋白启动子、白蛋白启动子和甲状腺素结合性球蛋白(TBG)启动子的肝特异性启动子的所述核酸分子的表达盒，其中所述核酸构建物任选地还包含内含子，特别是选自人类β球蛋白b2(或HBB2)内含子、FIX内含子、鸡β-球蛋白内含子和SV40内含子的内含子，其中所述内含子任选地是修饰的内含子例如SEQ ID NO：7的修饰的HBB2内含子、SEQ ID NO：9的修饰的FIX内含子或SEQ ID NO：11的修饰的鸡β-球蛋白内含子。

8.权利要求7的核酸构建物，其优选地以下述顺序包含：增强子；内含子；启动子，特别是肝特异性启动子；编码所述嵌合GAA多肽的核酸序列；以及多腺苷化信号，所述构建物优选地以下述顺序包含：ApoE控制区；HBB2内含子，特别是修饰的HBB2内含子；hAAT启动子；编码所述嵌合GAA多肽的核酸序列；以及牛生长激素多腺苷化信号，所述核酸构建物更特别地包含SEQ ID NO：20、21或22的核苷酸序列或由权利要求6中示出的任一组合产生的核苷酸序列。

9.一种载体，其包含权利要求1至8任一项的核酸分子或核酸构建物，所述载体是病毒载体，优选为反转录病毒载体例如慢病毒载体，或AAV载体例如单链或双链自身互补的AAV载体，优选为具有AAV来源的衣壳例如AAV1、AAV2、变体AAV2、AAV3、变体AAV3、AAV3B、变体AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、变体AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10例如AAVcy10和AAVrh10、AAVrh74、AAVdj、AAV-Anc80、AAV-LK03、AAV2i8和猪AAV例如AAVpo4和AAVpo6衣壳或具有嵌合衣壳的AAV载体，其中所述AAV载体更特别地具有AAV8、AAV9、AAVrh74或AAV2i8衣壳，特别是AAV8、AAV9或AAVrh74衣壳，更特别是AAV8衣壳。

10.一种细胞，其用权利要求1至6任一项的核酸分子、权利要求7至8任一项的核酸构建物或权利要求9的载体转化，其中所述细胞特别是肝细胞或肌细胞。