[发明专利]无细胞DNA的回收方法

说明书

通过使用表面吸附有水溶性的中性聚合物的氧化铝作为载体，能够从少量的体液试样中高效地回收无细胞DNA。

技术领域

本发明涉及回收无细胞DNA的方法。

背景技术

由于使用核酸的实验技术的发展，新的基因探索及其分析成为可能。例如为了特定癌等疾病而分析人的基因组，为了特定病原体的感染而分析它们的基因组等，在医疗现场中进行利用基因分析的筛选检查、临床检查等。

近年来核酸中无细胞DNA特别受到瞩目，通过对肿瘤来源的无细胞 DNA中存在的癌特有的基因突变进行分析来对治疗药判定有无效果等与临床直接联系的研究盛行。

例如，如下治疗药已经被承认：对于检测到EGFR基因突变的肺癌患者，厄洛替尼(Erlotinib)；对于检测到BRAF基因突变的皮肤癌患者，维罗非尼(Vemurafenib)；对于检测到BRCA基因突变的卵巢癌患者， Rubraca(rucaparib)。另外，已知针对这些基因突变的靶向治疗药效果超越癌的种类而共通，例如，针对BRAF基因的V600突变的治疗药达帕菲尼(Dabrafenib)在皮肤癌和非小细胞肺癌的患者的两方中都被推荐。

然而，到目前为止为了获得癌特有的基因，一般要从手术切除的癌组织中回收基因。切除组织的获得对患者的侵袭性高，有根据采取多种癌组织的哪一部位而结果不同的问题，还有不适合手术前的治疗等问题。近年来，报告了体液中存在的无细胞DNA中也可以存在癌特异的基因突变，迫切要求不切除癌组织地检测基因突变。

另外认为，一旦患癌，则无细胞DNA从癌细胞释放到血中，因而癌患者与未患癌者相比血中含有更多量的无细胞DNA(专利文献7)。因此，如果能够正确地测定无细胞DNA的量，则能够使用体液试样低侵袭且简便地进行癌的检测。专利文献7中记载了基于用硅胶膜回收的无细胞DNA 的量来检测癌的方法。

然而，体液中存在的无细胞DNA为少量，而且为了分析无细胞DNA 序列上存在的癌特有的突变点，在无细胞DNA中需要检测血中的总DNA 中的等位基因频率仅为0.1％～几％左右的肿瘤细胞来源的被称为无细胞肿瘤DNA(cell-free tumor DNA，ctDNA)的无细胞DNA，需要以高收率回收无细胞DNA的技术。

现在，作为一般进行的核酸的回收方法，可列举酚-氯仿提取法、乙醇沉淀法和对二氧化硅的核酸吸附法等作为代表方法。其中最通用的方法是专利文献1中记载的使核酸吸附于包含二氧化硅的金属氧化物然后使其溶出而回收的Boom法。该方法具有在通过离心操作从吸附了核酸的二氧化硅回收核酸的同时能够浓缩核酸的特征。

专利文献2中记载了在Boom法的同时对二氧化硅使无细胞DNA吸附的技术。据此，如果将酚-氯仿提取在酸性条件下进行，则RNA被分离到水相中、DNA分离到被氯仿相中，如果在中性条件下进行，则RNA和 DNA被分配到水相中。即，能够通过改变提取溶液的条件而选择性地提取想要获得的核酸。

然而，这些专利文献1、专利文献2所述的方法中，在核酸的吸附过程中醇等有机溶剂的使用是不可缺少的，因而有溶剂废弃的问题，回收操作也复杂。此外，还有在分离后的核酸中混入这些有机溶剂，然后影响检测反应的问题。

另外，专利文献3中记载了具有300碱基对～1000碱基对的碱基长的核酸对二氧化硅的吸附性比具有更短的碱基长的核酸的吸附性差，进而预计在回收短的无细胞DNA时，使用二氧化硅的方法不适用。

专利文献4和5没有关于无细胞DNA的记载，但记载了不利用有机溶剂的核酸的回收方法。专利文献4中记载了使核酸吸附于α-氧化铝粒子、氧化锆粒子、二氧化钛粒子等而有效地回收的方法。另外，专利文献5中记载了使用离子交换层析的原理使核酸吸附、回收的方法，显示作为阴离子交换材料可以利用氧化铝。

专利文献6中记载了依赖于溶解核酸的溶液，能够使核酸牢固地结合于α-氧化铝、和γ-氧化铝，或相反阻止结合。另外记载了，结合的核酸即使反复洗涤也基本不溶出。