[发明专利]突变型酶的制造方法及突变型醇酰基转移酶

说明书

作为用于使目标蛋白在转化体中以活性的可溶性重组蛋白形式表达的高效的方法，提供一种酶的制造方法，所述酶与基准体相比每种重组体的活性得到提高，该方法包含以下的工序：(1)制作表达突变体的重组体的工序，所述突变体具有在基准体的氨基酸序列中1个以上的半胱氨酸被置换为其它氨基酸残基的氨基酸序列；(2)选择与基准体的活性100％相比显示50％以上的每种重组体的活性的多个突变体的工序；和(3)表达以下突变体的工序，所述突变体为在工序(2)所选择的各个突变体所具有的氨基酸残基被置换的部位中的2个以上部位中、各自对应的氨基酸残基被置换的突变体。

技术领域

本发明涉及突变型酶的制造方法及突变型醇酰基转移酶。更详细而言，涉及用于得到作为高活性的可溶性重组蛋白的醇酰基转移酶等酶的方法等。

背景技术

蛋白质在细胞内完成翻译后折叠成固有的立体结构，从而具有功能。在使用转化体(重组体)表达异种蛋白质时，存在在宿主细胞内不进行蛋白质的正常折叠而形成包涵体的情况。已知包涵体中的蛋白质为丧失了本来活性的无活性型蛋白质，某些情况下是不溶的。一般认为，在与蛋白质的来源种属的细胞内环境(温度、转录速度、翻译速度等)不同的宿主细胞内环境下不能进行该蛋白质的正常折叠是形成包涵体的主要原因。

为了解决该问题进行了以下尝试：在蛋白质中导入突变，从而在重组体中实现与野生型蛋白质同样的正常折叠，获得表达为活性型的突变蛋白。例如，关于来自植物的羟基腈裂解酶，报道了通过导入突变可获得可溶性大幅提高的酶(非专利文献1)。

对与本发明相关的醇酰基转移酶(AAT)进行说明。专利文献1～3中提出了使用醇酰基转移酶(AAT)由利用生物质生成的异丁酰辅酶A、甲基丙烯酰辅酶A来制造异丁酸酯、甲基丙烯酸酯的方法。

羧酸酯类被用作各种工业用化学品、香料、药品等的原料。例如，异丁酸酯主要作为香料用酯类、药品、过氧化物等的原料，是重要的酯化合物。甲基丙烯酸酯主要作为丙烯酸类树脂的原料使用，作为涂料、粘接剂、树脂改性剂等领域的共聚单体也有较多的需求。

近年来，从防止全球变暖及环境保护的观点出发，使用生物质代替以往的化石原料作为碳源来制造各种化学制品的技术受到关注。对于异丁酸酯、甲基丙烯酸酯，也期待由生物质来制造。

作为使用AAT由生物质合成异丁酸酯、甲基丙烯酸酯等酯的方法，考虑了使用微生物重组体的发酵生产，其中，所述微生物重组体导入了由生物质合成异丁酰基辅酶A、甲基丙烯酰辅酶A等辅酶A化合物的基因组以及催化由辅酶A化合物向酯的反应的AAT基因。

但是在重组体中表达AAT时，会有上述的形成包涵体的问题。已知在以大肠杆菌为宿主表达来自植物的AAT时，大部分会表达为无活性的不溶性蛋白质(非专利文献2)。

非专利文献3、4报道了：在使大肠杆菌重组体表达来自苹果的AAT的情况下，仅在使用特定的品系(C43(DE3))时得到可溶性蛋白质，在一般的品系(BL21(DE3)诱导株)的情况下得不到可溶性蛋白质。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2015-116141号公报

专利文献2：国际公开2014/038214号

专利文献3：国际公开2014/038216号

非专利文献

非专利文献1：Protein Eng.Des.Sel.(2011)24：607-616.

非专利文献2：Metabolic Engineering(2015)27：20-28.

非专利文献3：FEBS J.(2005)272：3132-3144.