[发明专利]基于FraC actinoporin的用于生物聚合物传感和测序的生物纳米孔

说明书

本发明大体上涉及纳米孔及其在各种应用中的用途领域，例如生物聚合物和大分子的分析，通常通过在经纳米孔迁移期间进行电测量。提供了一种包含漏斗形蛋白质纳米孔的系统，所述纳米孔包含α‑螺旋成孔毒素，所述α‑螺旋成孔毒素是来自actinoporin蛋白家族的成员，更特别的是Fragaceatoxin C(FraC)、突变型FraC、FraC旁系同源物或FraC同系物。

本发明大体上涉及纳米孔及其在各种应用中的用途领域，例如生物聚合物和大分子的分析，通常通过在经纳米孔迁移期间进行电测量。

纳米孔代表了分析生物聚合物的有吸引力的方式，例如确定多肽或多核苷酸的身份，或估计聚合物中各个结构单元的身份以用于测序目的。这是因为该方法无标记物，提供了依赖于少量甚至单个分子的测量，并产生高度可缩放的电信号。

在利用纳米孔的测量系统中，系统的一些性质取决于纳米孔中的核苷酸，以及采用该性质的电测量。例如，通过将纳米孔置于绝缘膜中并在多核苷酸的核苷酸存在下测量通过纳米孔的电压驱动的离子流来产生测量系统。

纳米孔已成为单分子监测化学和酶促反应，蛋白质检测和核酸测序的有效方法[1],[2]。已显示Phi29[3]以及ClyA[4]允许双链DNA的迁移。最近，使用aerolysin来区分由腺嘌呤组成但长度不同的均聚物[5]。迄今为止，仅显示αHL和MspA能区分核酸。两个纳米孔在其跨膜区中具有β-折叠。当 DNA穿过MspA时，电流阻断水平受到四个或更多核苷酸的影响[6]，而αHL 在其桶形结构中有三个传感区，可容纳约20个核碱基[7]。

本发明提供了具有不同结构和识别位点的新型纳米孔，其提供了测序精确度的改进和/或提供不同的误差分布。在这里，我们描述了Fragaceatoxin C(FraC)的纯化和预寡聚化，Fragaceatoxin C是一种来自actinoporin蛋白家族的成员的α-螺旋成孔毒素，与鞘磷脂复合并重建成由1,2-二植烷酰-sn-甘油 -3-磷脂酰胆碱(DPhPC)组成的平面脂质双层。本发明人进一步设计了一种 FraC突变体(例如ReFraC)，其允许ssDNA的捕获和迁移以及区分用中性抗生物素蛋白(NA)固定的腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的均聚物。引人注目的是， dsDNA可以通过FraC迁移，很可能是经纳米孔的弹性变形的α-螺旋收缩。

值得注意的是，发现FraC纳米孔具有用于蛋白质测序和折叠蛋白质分析的理想形状。在下文中显示，电渗流是诱导蛋白质和多肽进入纳米孔内的主导力。通过精确改造纳米孔的收缩或通过改变溶液pH来调整纳米孔的内表面，可以观察到带正电荷和带负电荷的多肽的迁移。这是值得注意的，因为这表明在固定的施加电位下可以诱导足够强的电渗流来运送正和负残基。引人注目地发现是，一系列(未折叠的)不同大小的蛋白质，例如，在1.2-25kDa 范围内的蛋白质，可以根据个体阻塞进行区分。使用20个氨基酸的模型多肽，证明甚至通过纳米孔记录可以观察到单个氨基酸残基的差异，表明FraC 纳米孔允许鉴定迁移多肽中的特定序列特征。

此外，本发明人设计了一种在无鞘磷脂的平面脂质双层中重构预寡聚化的FraC纳米孔的方法。ReFraC纳米孔被改造为允许电泳DNA捕获并显示 ssDNA均聚物之间的区别。与用于测序DNA的其他纳米孔(例如αHL和 MspA)相反，FraC具有α-螺旋的V形跨膜区，这有利于微调核碱基辨别力。这是因为跨膜α-螺旋内不同位置的氨基酸取代可以调节收缩的大小和化学组成。

本文还显示ReFraC诱导DNA双链体在低施加电位下解链或允许它们在高施加电位下迁移。已经使用αHL纳米孔研究了DNA发夹或更高阶DNA 结构的解链[20],[21]。然而，ReFraC的顺式孔腔(5.5nm)比αHL(2.6nm)[13] 或MspA(4.8nm)[22]的顺式孔腔宽，表明FraC可以有利地用于研究较大的更高级的dsDNA结构，例如G-四链体，或折叠的RNA结构，例如tRNA。