[发明专利]生产含有血小板裂解物的凝胶的方法

说明书

本发明涉及生产用于制备三维凝胶状基质的材料的方法，其中提供血小板浓缩物，并从该血小板浓缩物中收获血小板。然后裂解血小板以产生血小板裂解物，随后将所述血小板裂解物冻干，以提供干燥的血小板裂解物凝胶材料。本发明还涉及包含血小板裂解物的血小板裂解物凝胶材料，其中该材料是冻干的干燥材料。通过在使用地点加入水可以容易地重建冻干凝胶，以提供完全功能性的血小板裂解物凝胶，其可以用于培养活细胞而没有任何限制。因此，该方法有利于凝胶材料的运输并确保血小板裂解物凝胶的更长的保质期，而对细胞培养性质没有任何影响。与没有冻干的新鲜制备的hPL‑凝胶相比，在这种冻干的hPL‑凝胶上生长的细胞显示出相似的细胞增殖和扩增速率，并且没有观察到冷冻干燥对接种的MSC的分化潜能和免疫表型谱的影响。

背景技术

本发明涉及一种生产用于制备三维凝胶状基质的材料的方法。本发明还涉及血小板裂解物凝胶材料及其用途。

现有技术

细胞通常在补充有胎牛血清(FCS)或其他血清的培养基中培养，以便为细胞提供必需的生长因子。虽然没有任何细胞类型实际上需要血清用于生长，但是大多数敏感细胞类型(例如干细胞)现在仍然依赖于含血清的培养基。然而，鉴于治疗应用，人们越来越关注避免使用FCS，因为潜在的异种免疫反应(例如抗FCS抗体)、牛病原体(病毒和朊病毒)以及阻碍结果可重复性的高批次间变化(Heiskanen et al.,2007；Sundin et al.,2007)。化学上定义的合成培养基现在可商购获得，但它们的精确组成通常未公开，并且它们通常包括其他异种组分，例如重组生长因子。

人血小板裂解物(HPL)代表了FCS的另一种有吸引力的替代方案。HPL可以通过简单的冻融程序从常见的血小板单位产生。甚至可以使用来自相同供体的HPL以进一步降低免疫副作用或病毒感染的风险。这些研究是用来自骨髓的间充质基质细胞(MSC)进行的，最近已经证明HPL也可用于从人脂肪组织中分离MSC(Blande et al.,2009)。

EP 0 413 727 B1公开了一种制备血小板裂解物和HPL培养基的方法。根据该已知方法，将柠檬酸盐加入全血中以避免凝血。将来自该血液的血浆离心以获得富含血小板的糊状物，然后加入Ca²⁺以裂解血小板并凝结其余组分。将过滤的透明裂解物与常规营养组合物混合，以获得含HPL的培养基。

此外，WO 2008/034803 A1公开了包含无血浆血小板裂解物的细胞培养基补剂。补剂还包含其他物质(例如白蛋白和葡聚糖)。为了制备补剂，通过冷冻和解冻裂解血小板，并加入柠檬酸葡萄糖(ACD)或柠檬酸磷酸盐葡萄糖(CPD)作为抗凝血剂。

然而，许多细胞，例如间充质基质细胞(MSC)，在塑料粘附单层中生长，直到它们接触抑制。细胞的增殖速度迟早会衰减，直到它们最终达到衰老状态。这伴随着形态的扩大、表面标志物的表达降低和分化潜能降低。由于不同的亚群、细胞凋亡、以及最后但并非最不重要的集落内的接触抑制，该过程不会在培养的细胞中平行发生。较低的接种密度有利于细胞传代的较高间隔，因此，增殖只能发生在较大集落的边缘。因此，当使用塑料粘附单层培养物时，几乎不可能实现可靠的扩增并使接触抑制最小化。此外，如果不使用破坏细胞的肽酶处理，也不可能进行细胞传代。对于干细胞培养物，塑料粘附单层培养物的另一个缺点是塑料表面可能导致细胞的不期望的分化。

WO 2013/000672 A1公开了使用包含血小板裂解物和抑制凝胶化物质的液体培养基培养细胞的方法。将细胞培养在包含血小板裂解物(但基本上不含抑制凝胶化的物质)的三维凝胶状基质的表面上和/或内部，其中液体培养基层叠在凝胶状基质上，以便建立两相系统。与在组织培养塑料(TCP)上培养的MSC相比，在该凝胶上培养的间充质基质细胞(MSC)显示出显着更高的增殖速率。然而，尽管凝胶状基质非常适合培养细胞，但是因为它不能长距离运输并且在较长的时间内不稳定，必须在使用地点制备凝胶，这仍然是缺点。

发明内容