[发明专利]细胞培养装置以及细胞培养方法

说明书

本文描述了在微流体装置上血管化细胞聚集体的方法、包括可灌注的血管网络的微流体细胞培养装置、试剂盒以及使用微流体细胞培养装置的分析方法。所述微流体装置包括一个或多个毛细管压力屏障，其允许细胞外基质凝胶在网络的限制区域内形成，在该细胞外基质凝胶中培养的细胞用于不同用途。

技术领域

本发明涉及一种用于对细胞进行3D培养的装置和方法，例如，能够对类器官分析和/或细胞培养物进行可控的且可靠的血管化和/或灌注的多孔板。同样，本发明提供用于产生3D培养的细胞的方法和用于使培养的细胞的血管化/对培养的细胞进行灌注的方法，以及由该装置和方法产生的分析板及其用途。

背景技术

近年来，在类器官培养领域，用于药物检测和疾病模拟的预测性表型模型取得了长足发展。类器官是三维的器官芽，通常包括同样存在于人体内的大多数特化细胞。在实际使用中，在体外环境中模拟胚胎再生发育过程中的组织培养和分化使得干细胞分化为各种不同的分化的细胞。

这种类器官的一个众所周知的例子是小肠类器官(Shoichi Date and ToshiroSato,Mini-Gut Organoids:Reconstitution of the Stem Cell Niche,Annu.Rev.CellDev.Biol.,2015,Vol.31:269-289)。生长因子和信号分子(例如，Wnt通路激动剂(例如Wnt3a、R-spondin、CHIR99021)、BMP/TGF通路抑制剂(例如Noggin)、EGF)的混合物以及基底膜提取物(基质胶或类似物)的环境确保了原代肠隐窝的培养、肠干细胞龛的维持以及细胞向例如杯状细胞、肠上皮细胞和肠内分泌细胞分化的潜能。这样就产生了具有二代肠形态特点的三维结构，包括隐窝和绒毛结构。已建立了类似的三维培养物用于原代人食管、胃、结肠、肝脏和胰腺的培养。

近来，在由诱导多能性干细胞生长脑类器官这一方面已取得进展。悬浮球体在连续振动条件下的长期培养产生了具有诸如前脑和后脑特征之类的特定部分的所谓的迷你脑[Cerebral organoids model human brain development and microcephaly,M.A.Lancaster,et al.Nature 2013,501,373–379]。最近，如下的肾小球培养方式已取得了突破性进展，该肾小球培养方式使用复杂的培养方案，在细胞迁移系统(transwellsystem)上从诱导多能性干细胞开始，这种肾小球的培养方式同样产生了存在于人肾小球中的高度特化的细胞[Kidney organoids from human iPS cells contain multiplelineages and model human nephrogenesis,M.Takasato et al.,Nature 2015,526,564–568]。

类器官培养或更一般而言，3D细胞培养可以以多种方式进行。3D球体可以在所谓的悬挂式滴板(参见例如WO 2010/031194)或低粘附微量滴定板中形成。尽管据称这些球体显著提高了对标准细胞培养的预测性，但是它并不适用于大多数类器官培养。原因在于类器官通常需要细胞外基质成分，例如不存在于悬挂式滴板或低粘附板的球体中的基质胶(Matrigel)或胶原蛋白。同时，还开发了3D细胞培养模型，在该3D细胞培养模型中细胞生长嵌入至细胞外基质中的。这种方法增强了分化的功能的表达并改善了组织结构(Pampaloniet al.(2007).Nat Rev Mol Cell Biol 8:839-84)。

典型的类器官生长平台包括标准培养皿、微量滴定板，在某些情况下还包括来自Corning的板。在这些情况下，类器官在细胞外基质(ECM)中或在涂有ECM的孔上生长。正如上面已经提到的，这些类器官缺乏血管，由此类器官生长超过一定尺寸会发生缺氧并在后期可能形成坏死核心，从而限制了类器官的生长。同时，由于内皮细胞向靶组织分泌重要因子，因此可以假设内皮细胞的存在对于向生理相关组织的发育是至关重要的。

微流体细胞培养是一项日益重要的技术，其在药物筛选、组织培养、毒性筛选和生物学研究中得到应用。