[发明专利]允许更高光强度的利用时间相关单光子计数的荧光寿命成像显微学方法

说明书

一种利用时间相关单光子计数的荧光寿命成像显微学方法，借助脉冲式光源(12)周期性地以激发光脉冲对样品(36)进行激发以发射荧光光子，在每两个相继的激发光脉冲之间定义测量间隔；借助探测器(42)检测荧光光子并且产生代表检测到的荧光光子的模拟探测器信号；基于探测器信号确定探测时间，荧光光子在相应的测量间隔内在探测时间上被探测器(42)探测到；基于检测到的荧光光子的探测时间，确定至少一个表征荧光衰减特性的参量，借助表征参量进行成像。在相应的测量间隔内在多个采样间隔内对模拟探测器信号进行采样并且将模拟探测器信号转换成离散的配属于各个采样间隔的信号值的序列。借助属于相应的测量间隔的离散信号值序列，确定在该测量间隔内是否检测到多于预定数量的荧光光子，当多于时，放弃将该测量间隔用于确定表征参量。

技术领域

本发明涉及一种利用利用时间相关单光子计数的荧光寿命成像显微学方法以及一种用于实施这样的方法的显微镜。

背景技术

荧光寿命成像显微学，简称FLIM(“fluorescence lifetime imagingmicroscopy”)是一种荧光显微成像方法，该荧光显微成像方法基于对荧光分子的激发态的不同寿命的测量。借助测得的寿命例如可以推断出荧光分子的环境的特性，例如pH值、温度、离子浓度、FRET转移(荧光共振能量转移)等。

荧光寿命可以直接在时间范围内确定(“时域寿命测量”)或者在一种备选的方法中在频率范围内确定(“频域寿命测量”)。在时间范围内的确定可以根据所谓的时间相关单光子计数、简称TCSPC(“time correlated single photon counting”)的方法来实现。在该方法中，单个地检测由于周期性地以激发光脉冲进行激发而释放的光子。为此与此相应地需要能够实现这样的单光子检测的探测器。所使用的激发光脉冲在此通常具有皮秒范围内的脉冲持续时间，该脉冲持续时间明显短于典型的处于纳秒范围内的荧光寿命。通常测量在激发光脉冲与紧接着其的由探测器检测到荧光信号之间的时间。这样所检测的荧光光子然后经由多次测量而汇集成直方图。在这样的直方图中绘出关于测得的时间的光子数量。以该方式通常能够观察到由检测到的单光子所代表的荧光强度的与时间相关的指数型减少，由此确定荧光寿命。

此时，上述基于单光子计数的方法的问题在于，传统的探测器紧接着在检测到一个单个光子之后在一定的时间段上不再次准备好证实另一个光子。该时间段也称为探测器的死区时间。传统探测器的典型死区时间处于大约50纳秒至100纳秒的范围内。因此，在所观察的在两个相继的激发光脉冲之间定义的测量间隔内，通常限制于探测到的第一荧光光子。

由于仅观察到在一个激发光脉冲之后相应出现的第一荧光光子，可能出现较小的时间份额在直方图中的权重较高。该使测量结果错误的较高权重在专业圈内也称为堆积效应。为了避免该堆积效应，典型地这样调整入射的激发光脉冲的强度，使得每个激发光脉冲仅释放1/10的光子。在该调整中存在如下可能性，即：对于每个激发光脉冲检测两个荧光光子，存在大约1％的可能性。然后可以忽略堆积效应。然而，这样强烈减小激发光强度导致相应长的曝光时间，这又使得该方法难以广泛应用。

为了解决以上所阐述的问题，在现有技术中存在一系列方案。一方面，在文献DE10 2011 055 330 A1、DE 10 2011 055 945 A1和DE 10 2011 052 334 A1中这样提出并行化分析电子装置，使得从探测器信号获取的数字数据序列被传输至能够实现对数据序列的快速信息处理的串并转换器。然而，分析电子装置的该并行化在技术上是耗费的并且因此涉及巨大的成本。

在WO 2010/089363 A1中提出对堆积效应进行数值修正。然而，该数值修正以期望结果的模型为前提并且因此不能通用。