[发明专利]用于抗微生物剂敏感性预测的流式细胞术数据处理

说明书

一种在易感、中间和抗性表型中预测测试微生物对抗微生物剂的敏感性表型的方法，所述方法包括学习阶段和预测阶段。学习阶段包括选择具有根据EUCAST或CLSI方法所测定不同已知敏感性表型的广泛不同菌株，对于液体样品中分配的各个所述菌株获得FCM分布，所述样品具有荧光标记物和不同抗生素浓度，以及在涉及衍生自FCM采集的特征向量的单或多维空间上进行学习机计算，以获得对所述抗生素敏感性表型的预测模型。

技术领域

本发明涉及用流式细胞术预测微生物对抗微生物剂的敏感性，尤其是细菌对抗生素的敏感性。

发明背景

众所周知，就抗微生物剂定义了2个关键浓度或“断点”，且如果就微生物测量的最低抑菌浓度(“MIC”)低于第一断点，则微生物对所述试剂易感，如果所测MIC高于第二断点，则微生物耐受所述试剂，且如果所测MIC位于两者之间，则微生物对所述试剂是中性的。目前用于实验室的金标方法通常基于生长抑制的测量，所述方法用于评估微生物的MIC和随后其对抗微生物剂的敏感性表型。这些技术包括肉汤微量稀释参照法以及手工和自动化替代方法如平板扩散法、琼脂稀释法或VITEK 仪器等。

在过去几十年中，研究显示早期细菌生理变化能通过大量市售可得荧光标记物呈现，使用流式细胞术(“FCM”)或基于显微镜/成像的技术[1-5]。众所周知，流式细胞术基本由以下组成：生成携带对齐粒子(如微生物)的液流，所述粒子单独通过激光束，并测量对所述各粒子束的光响应，即其荧光、其前向散射光和其侧向散射光。具体地，基于FCM的单细胞分析能允许快速监测接触抗生素后的细胞计数[6-10]或平均荧光强度[11,12]。其它抗生素诱导的细胞形态、大小、光散射和自发荧光性质的变化也可通过FCM检测，如前面文献[13-15]所报道。在近期的专利申请中，建议通过测量细胞增大来研究抗生素易感性谱，但未描述稳健的分析方法以定义表型之间的区分阈值[16]。迄今为止，主要基于平均分布率的仅弱定量或任意阈值被用于区分易感与抗性群体。另外，仅做了不多的努力来组合不同特征如荧光和散射数据以解决对抗微生物剂的反应的复杂性。因此，仍然缺乏充分利用FCM数据信息优势以建立有力的抗生素易感性预测算法的稳健策略，尽管进行许多尝试来显示FCM用于快速抗生素敏感性测试(“AST”)的价值。

例如，专利申请WO 2012/164547 A1[17]描述基于使用断点浓度的方法。简言之，在抗生素存在下快速孵育后，细菌用荧光标记物标记并通过FCM分析。就易感和抗性参照断点浓度二者计算经抗生素处理与未处理细胞之间平均荧光强度(“MFI”)之比，也称为染色指数(“SI”)。例如，若使用标记活细胞的荧光标记物，预期易感菌株在抗生素处理时显示低MFI值。因此，解释如下：a)如果在易感参照断点SI1，则预测菌株对抗生素易感；b)如果在抗性参照断点SI≥1，则预测菌株为抗性。另一方面，如果使用靶向细胞损害的荧光标记物，预期易感菌株显示高荧光值。因此，解释如下：a)如果在易感参照断点SI1，则预测菌株为易感菌株；b)如果在抗性参照断点SI≤1，则预测菌株为抗性。