[发明专利]使用IP-质谱法的抗体验证

说明书

本发明部分地涉及用于利用免疫沉淀和质谱法验证抗体的组合物和方法。

技术领域

本发明部分地涉及利用免疫沉淀和质谱法验证抗体的组合物和方法。

背景技术

抗体被用在宽范围的研究和诊断应用中用于蛋白的富集、检测和定量和它们的修饰。针对数千种蛋白的数万种抗体是商购可得的，它们被用在多种应用中，包括蛋白质印迹法(WB)、免疫荧光(IF)、免疫沉淀(IP)、流式细胞计量术(FC)、染色质IP(ChIP)、酶联免疫测定(ELISA)和基于珠子的夹心测定(例如Luminex)。这些抗体可以是来自不同生物的单克隆抗体或多克隆抗体，且它们可以用于查询生物系统和信号传递途径、诊断疾病和评估对治疗的应答(参见Lipman,N.S.等人,ILAR Journal 46(3):258-268(2005))。

不幸的是，在最初和在制备批次之间，大多数抗体被较差地表征。这是由于至少三个挑战：1)蛋白靶标和抗体的绝对数目可以是压倒性的；2)每种抗体靶标、应用和模型系统的独特要求和挑战(诸如天然的相对于变性的表位构象或未刺激的相对于刺激的细胞)；和，3)用于评估抗体选择性的一致标准方案和标准的缺乏(参见Madhusoodanan,J.Validating Antibodies:An Urgent Need.2014；和Bordeaux,J.等人,Biotechniques48(3):197-209(2010))。对改进的抗体验证方案和标准存在巨大需要，以确保所述试剂适合目的。已经提出多种用于抗体验证的推荐，并且巩固的抗体注解和性能“评分”信息的数据库是可自由得到的(例如，Antibodypedia,如在Bjorling,E.和UhlenM.Mol.Cell.Proteomics 7(10):2028-37(2008)中所述)。

已经提出了多种抗体验证标准，包括：1)用基因击倒或阻断肽评估抗体特异性；2)用不同的生物系统(靶标定位、模型系统等)验证抗体检测结果；3)方法之间的抗体结果的联系；和4)样品、实验室和制备批次之间的再现性的证实(参见Bordeaux,J.等人,Biotechniques 48(3):197-209(2010),Bjorling,E.和Uhlen M.Mol.Cell.Proteomics 7(10):2028-37(2008),以及Pauly,D.和K.Hanack,F1000Res 4:691(2015))。

近年来，已经为抗体验证提出质谱测定方案(参见Bostrom等人,J Proteome Res13(10):4424-35(2014)和Marcon E.等人,Nature Methods 12:725-731(2015))。尽管质谱法有成本和技术要求，但是在所有现有的验证方法中，质谱法具有鉴别实际抗体靶标、异形体、修饰和有关蛋白的独特能力。没有其它方法可以以MS的深度和特异性鉴别和表征抗体靶标。但是，不同于蛋白质印迹法、ELISA和使用阻断试剂如牛奶或牛血清白蛋白(BSA)的其它标准免疫学方法，为了使背景蛋白结合最小化，质谱法会检测样品中的所有特异性的和非特异性的蛋白。例如，使用固定化在珠子或树脂上的抗体的免疫沉淀是从裂解物或生物流体富集靶蛋白和有关蛋白的常见方案。

由于特异性靶标相对于普通背景蛋白的低丰度，当利用质谱法时，非特异性地结合的蛋白可能淹没低丰度靶标并干扰或阻止低丰度靶标的检测。即使使用严谨的洗涤条件和经优化的试剂，通常在通过质谱法分析的免疫沉淀的样品中观察到数十至数百种背景蛋白。因而，来自免疫沉淀的样品的质谱法结果可以难以过滤和解释。具体地，抗体对来自真实生物系统的天然蛋白的选择性的确保是特别难以证实的，部分地因为预期靶标相对于非特异性/背景抗体结合剂的极低丰度。

为了解决这些问题，我们已经开发了进行抗体验证的新方案。通过使用经优化的样品制备试剂和方法、现有技术仪器和新颖的数据分析流水线，已经建立了综合工作流来使用与质谱法组合的免疫沉淀(IP-MS，如在图1中所示)针对它们的预期靶标来验证抗体。该IP-MS方案的益处包括：鉴别抗体靶标、异形体和修饰，通过计算靶标的富集倍数和脱靶来定量评估抗体选择性，和准确鉴别和定量靶蛋白修饰和相互作用蛋白。