[发明专利]因子XA衍生物的制备

说明书

本公开提供了用于大规模制造fXa衍生蛋白从而获得高纯度蛋白质产物的高产率的方法。所述方法可包括将洗涤剂加入含有编码所述蛋白质的多核苷酸构建体的样品中，以及通过基于大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)的亲和色谱、离子交换和混合模式色谱和疏水相互作用来纯化所述蛋白质。

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2016年6月17日提交的美国临时专利申请序列号62/351,841的权益，其各自的内容以引用的方式整体并入本文。

背景技术

已经开发了因子Xa (fXa)蛋白的修饰衍生物，其可用作靶向fXa的抗凝剂的解毒剂。正在开发所述衍生物作为患者的通用逆转剂，所述患者用口服或可注射因子Xa抑制剂进行抗凝并且需要使所述抗凝逆转。

发明内容

本公开提供了用于大规模制造fXa解毒多肽从而获得高纯度蛋白质产物的高产率的方法。在一个实施方案中，提供了一种用于制备由多核苷酸构建体表达的多肽产物的方法，所述多核苷酸构建体包括SEQ ID NO: 7的核酸序列或编码与由SEQ ID NO: 7编码的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。所述方法可包括将洗涤剂加入含有多核苷酸构建体的样品中，以及通过基于大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)的亲和色谱、离子交换和混合模式色谱和/或疏水相互作用来纯化所编码的解毒蛋白。

在一个实施方案中，提供了一种用于制备由多核苷酸构建体表达的多肽产物的方法，所述多核苷酸构建体包括SEQ ID NO: 7的核酸序列或编码与由SEQ ID NO: 7编码的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的核酸序列，所述方法包括将洗涤剂加入含有多核苷酸构建体和由多核苷酸构建体表达的多肽产物的样品中；将样品加载到基于大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)的亲和色谱中，并用第一洗脱缓冲液洗脱多肽以产生第一洗脱样品，其中所加载的样品不含有机溶剂；将第一洗脱样品加载到离子交换和混合模式色谱中，并用包含至少1 M无机盐的第二洗脱缓冲液洗脱多肽以产生第二洗脱样品；以及将第二洗脱样品加载到疏水相互作用色谱中，并用包含至少2 mM氯化钠的第三洗脱缓冲液洗脱多肽，由此制备包含多肽产物的纯化的样品。

在一些实施方案中，洗涤剂包含Triton X-100 (聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚)。在一些实施方案中，第一洗脱缓冲液包含0.5 M至2 M精氨酸。在一些实施方案中，第一洗脱缓冲液具有约5至5.4的pH。在一些实施方案中，离子交换和混合模式色谱包括陶瓷羟基磷灰石I型色谱。

在一些实施方案中，第二洗脱缓冲液包含至少2 M的无机盐。在一些实施方案中，无机盐为氯化钠。在一些实施方案中，疏水相互作用色谱包括辛基琼脂糖凝胶色谱。

在一些实施方案中，所述方法还包括用阴离子交换色谱的纯化步骤。在一些实施方案中，阴离子交换色谱包含Sartobind^TM离子交换膜。

在一些实施方案中，所述方法还包括用纳米渔网膜(nanofleece)过滤器过滤一个或多个样品。在一些实施方案中，用纳米渔网膜过滤器的过滤在将样品加载到基于STI的亲和色谱之前进行。

在一些实施方案中，纯化的样品含有小于约1%的不是由多核苷酸构建体表达的污染蛋白。在一些实施方案中，多肽产物在含有多核苷酸构建体的细胞中表达。在一些实施方案中，细胞在培养基中在每升培养基产生至少100 mg多肽产物的条件下生长。在一些实施方案中，细胞在培养基中在每升培养基产生至少200 mg多肽产物的条件下生长。在一些实施方案中，纯化的样品含有大于约50%的培养基中产生的多肽产物。在一些实施方案中，纯化的样品含有大于约100 mg来自每升培养基产品的多肽产物。