[发明专利]青霉素-G 酰化酶

说明书

本发明提供了具有改进的特性的工程化青霉素G酰化酶(PGA)、编码该酶的多核苷酸、包括该酶的组合物以及使用该酶的方法。

本申请要求于2016年5月5日递交的美国临时专利申请系列号 62/332,103的优先权，出于所有目的将其通过引用以其整体并入本文。

发明领域

本发明提供了工程化青霉素G酰化酶(PGA)、编码该酶的多核苷酸、包含该酶的组合物以及使用该工程化PGA酶的方法。

对序列表、表格或计算机程序的引用

序列表的正式副本作为ASCII格式化文本文件经由EFS-Web以文件名“CX2-154WO1_ST25.txt”与说明书同时提交，创建日期2017年5月5日，且大小为8,962千字节。经由EFS-Web提交的序列表为说明书的一部分并且通过引用以其整体并入本文。

发明背景

青霉素G酰化酶(PGA)(青霉素酰胺酶，EC 3.5.1.11)催化青霉素G(苄基青霉素)侧链的酰胺键的裂解。该酶在商业上被用于制造6-氨基-青霉烷酸(6-APA)和苯基乙酸(PAA)。6-APA是工业生产半合成的β-内酰胺抗生素诸如阿莫西林、氨苄青霉素和头孢氨苄的关键化合物。天然存在的PGA 酶在商业过程中显示出不稳定性，需要固定在固体基底上以用于商业应用。 PGA已经被共价键接到多种支持物上，并且PGA固定系统已经被报道作为用于合成纯光学异构体的有用的工具。然而，附接到固体表面导致受损的酶特性，例如降低的活性和/或选择性和对溶质接触的限制。此外，尽管附接到固体基底允许捕获酶和在另外的加工循环中的再次使用，酶的稳定性使得此类应用可能受到限制。PGA酶促催化青霉素G形成6-APA是配向性(regiospecific)(它不裂解内酰胺酰胺键)和立体特异性的。生产6-APA 可能构成药品生产中酶促催化的最大利用。PGA与苯乙酰基部分相关的酶活性允许大量的伯胺以及醇的苯乙酰基衍生物的立体特异性水解。

发明内容

本发明提供了工程化青霉素G酰化酶(PGA)、编码该酶的多核苷酸、包含该酶的组合物以及使用该工程化PGA酶的方法。

本发明提供了能够通过向游离胰岛素的A1、B1或B29位置添加保护基团或者从A1/B1/B29三保护的胰岛素去除保护基团来产生乙酸苯酯单保护的或二保护的胰岛素的工程化青霉素G酰化酶。在一些实施方案中，青霉素G酰化酶与SEQ ID NO：4、8、14、300、1036、1194、1262和/或1288 至少约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多地相同。在一些实施方案中，本发明提供了能够从胰岛素去除A1、B1 或B29三-乙酸苯酯保护基团以产生二-乙酸苯酯保护的胰岛素的工程化青霉素G酰化酶，其中青霉素G酰化酶与SEQ ID NO：4、8、14、300、1036、 1194、1262和/或1288至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多地相同。在一些实施方案中，青霉素G酰化酶去除胰岛素的A1三-乙酸苯酯保护基团，而在一些另外的实施方案中，青霉素G酰化酶去除胰岛素的B1三-乙酸苯酯保护基团，且在又另外的实施方案中，青霉素G酰化酶去除胰岛素的B29 三-乙酸苯酯保护基团。在一些实施方案中，青霉素G酰化酶去除胰岛素的A1、B1和B29三-乙酸苯酯保护基团。在一些另外的实施方案中，与由多肽SEQ ID NO：2产生乙酸苯酯单保护的或二保护的胰岛素相比，工程化青霉素G酰化酶产生多于90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％、99％或更多的乙酸苯酯单保护的或二保护的胰岛素。