[发明专利]显微镜的光学路径中盖玻片的倾斜度测量和校正

说明书

本发明涉及一种在显微镜(1)的光学路径中调整样品保持件(7)的方法，其中将照明辐射(BS)中的至少一个束指引到样品保持件(7)上；通过检测器(19)检测由样品保持件(7)反射的一部分照明辐射(BSref)并且确定检测的照明辐射(BSref)的测量值；根据测量值，确定关于光学路径的样品保持件(7)的实际的目前位置；将确定的实际位置与期望的位置比较，并且产生用于修改实际的位置的控制命令，通过执行该控制命令将样品保持件(7)移动到期望的位置中。

技术领域

本发明涉及在显微镜的束路径中调整样品保持件的方法。

背景技术

光片显微术的主要应用中的一个存在于以几百μm上至若干毫米的尺寸来成像例如有机体的中型样品。通常，这些样品包埋在琼脂糖中并且布置在玻璃毛细管中。出于检查样品的目的，将玻璃毛细管引入到充满水的样品室中并且将具有样品的琼脂糖按压出毛细管一点。由光片照明样品。通过检测物镜，将样品中激发的并且从样品发出的荧光成像到特别是照相机的检测器上，该检测物镜垂直于光片并且因此还垂直于光片光学单元。

根据现有技术，光片显微术的显微镜1的布局(SPIM布局、单平面照明显微术)包括照明物镜2和检测物镜3(下面也称为SPIM物镜)，将照明物镜2和检测物镜3各自从上方相对于样品平面4以45°的角且关于彼此以直角指引到样品平面4上(参见图1A )。布置在样品平面4上的样品5位于例如实施为培养皿的样品保持件7的基底上。用例如水的液体8填充样品保持件7，并且在应用光片显微术期间将两个SPIM物镜2、3浸没在液体8中(未示出)。样品平面4延伸在由笛卡尔坐标系中的X轴X和Y轴Y所跨越的 XY平面中。第一光轴A1和第二光轴A2延伸在由笛卡尔坐标系中的Y轴Y 和Z轴Z所跨越的平面YZ中。

该方法提供了轴线方向上的高分辨的优点，因为薄光片6可以通过照明物镜2来产生。由于更高的分辨率，可以检查更小的样品5。此外，显著地降低麻烦的背景荧光并且由此改进信噪比。

根据现有技术，借助于通过位于样品5下方的宽场物镜20垂直穿过样品保持件7的透明基底所记录的宽场像，来产生与样品平面4和样品保持件 7平行的概览像。发射的光对样品5的照明并且捕获该发射的光在此是不可能的，因为两个SPIM物镜2、3相对于彼此布置得太紧。

为了在诸如多孔板的标准样品容器中促进更简易的样品准备，可以维持 45°配置但是具有倒置布置中的两个SPIM物镜2、3，将两个SPIM物镜2、 3从下方穿过样品保持件7的透明基底指引到样品平面4中(图1B )。在这个布置中，必须通过使用特别的光学元件来校正由样品保持件7引起的像差，该样品保持件7相对于光轴A1和A2倾斜并且以盖玻片的形式出现。穿过样品保持件7的基底照明布置在样品平面4中的样品5，并且检测样品5的激发的荧光。可以使用诸如多孔板、培养皿和/或物体支撑件的样品保持件7，并且特别地在高通量筛选的情况下可以避免样品5的污染。

如果例如Alvarez板12布置在照明物镜2和/或检测物镜3的束路径中 (图1B )，则其它技术难题发生(US 3305294 A)。Alvarez板12以它们校正像差的方式来实施，该像差可能恰好发生在例如盖玻片的样品保持件7和相应的物镜2、3的光轴A1、A2之间设定的角的情况下。导致较差图像质量的不需要的像差已经发生在小角度偏离(例如＜0.1°)的情况下。因此，例如在实验开始之前必须将盖玻片对准使得角度偏离位于可容许的公差内。此外，有帮助的是，如果除了角度以外，在物镜2、3之间的距离或者可能出现的附加的透镜(例如弯月形透镜)以及盖玻片也是可调整的，使得样品5或其将要成像的区域位于检测物镜3的像平面BE中。

DE 10 2007 046 601 A1公开了在反射的光系统中调整灯具的设备。至少一个孔径光阑布置在所述反射的光系统中的反射的光照明束路径中。检测器布置在反射的光系统的检测束路径中。反射的光照明束路径和检测束路径一起延伸并且在部分反射的光系统中平行。在部分反射的光系统中，光学元件是可定位的，随着光学元件将孔径光阑成像到检测器上。