[发明专利]用于取样齿龈代谢物的方法

说明书

本发明提供一种或多种用于取样齿龈代谢物和生物标志物的方法。

技术领域

本发明涉及在特定部位处非侵入性地收集齿龈样品，提取和分析代谢物；使用代谢物诸如瓜氨酸、鸟氨酸、琥珀酸来监测齿龈的健康状态的方法。

背景技术

牙周病，诸如齿龈炎和牙周炎，涉及由微生物群落和宿主免疫应答引起的齿龈组织中的慢性炎症。它们是世界上最普遍的疾病之一，并且仍然是当今世界牙齿脱落的最常见原因，并且可以影响全世界高达90％的人口。根据FDA专论(12CFR Part 356，第68卷，第103期(2003))将齿龈炎定义为“最常由牙菌斑引起的齿龈的炎性病变。齿龈炎的特征在于组织肿胀和发红、点彩(正常状态，其中健康齿龈的表面由小叶构成)丧失、有光泽的表面和增加的组织温度。齿龈也可能在轻微刺激(诸如刷牙)时出血或可能自发出血。齿龈炎通常不会疼痛。”在健康的齿龈中，微生物群落与宿主处于稳态平衡，并且宿主免疫系统限制细菌过度生长并中和有毒产物，诸如脂多糖(LPS)和脂磷壁酸(LTA)。随着细菌在齿龈边缘或龈下缝隙中过度生长，宿主和细菌之间错综复杂的平衡被破坏。来自宏基因组学研究的最新数据显示，在龈上和龈下菌斑中菌种增加，诸如苍白普雷沃菌(Prevotella pallens)、中间普雷沃菌(Prevotella intermedia)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)和龈沟产线菌(Filifactor alocis)。虽然齿龈炎和牙周炎的病因仍然难以捉摸，但有一点是清楚的；与临床确定的疾病部位相比，牙菌斑的组成在健康部位显著不同。这一观察结果，以及使用基因组学、蛋白质组学和代谢组学中新开发的工具表征宿主和细菌相互作用的进展，导致注意到齿龈炎和牙周炎是宿主和多微生物群落之间破坏的稳态的结果(Lamont RJ和Hajishengallis G.Polymicrobial synergy and dysbiosis in inflammatorydisease.G Trends Mol Med.2015；21:172-83)。

牙菌斑中的多微生物群落产生各种毒力因子；例如，许多细菌产生消化酶(诸如透明质酸酶)以分解将宿主细胞粘合在一起的多糖、溶解血凝块的纤维蛋白的纤维蛋白溶解酶和降解结缔组织中胶原蛋白的胶原酶。革兰氏阴性细菌分泌内毒素，也称为LPS，而革兰氏阳性细菌产生LTA和肽糖。此外，一种病原菌可以产生多种毒力因子；例如，据报道，牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)产生多种毒力因子，这些因子参与牙周组织的炎性和破坏性事件。这些影响因子包括荚膜、外膜、其相关的LPS、菌毛、蛋白酶和选定的酶。

LPS是所有革兰氏阴性细菌的整体组分，并且存在于外膜层中。牙龈卟啉单胞菌LPS具有显著量的含有四酰化和五酰化结构的异质性。它们中的一些已被纯化。LPS1690是高毒性的，而LPS1435/1449相对温和。从化学上讲，LPS由亲水性多糖和被称为脂质A的疏水脂质部分组成。后者是LPS分子的实际毒性部分，并含有显示对其促炎活性必不可少的磷酸根基团。从机制上讲，LPS首先结合到LPS结合蛋白(LBP)，然后将LBP-LPS复合体转移至膜结合的CD14，从而能够与细胞膜上的Toll样受体(TLR)4相互作用。LPS与细胞膜上的TLR4的结合激活TIRAP-MyD88依赖性NFkB和TRAM-TRIF依赖性IRF3或IRF7两者信号转导途径，并随后刺激促炎细胞因子和趋化因子(诸如干扰素(IFN)γ、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8和IL-12)的产生。此外，诱导产生一氧化氮、前列腺素、白三烯和蛋白水解酶。重要的是，据报道LPS在小鼠和大鼠中引起牙周炎。

牙龈卟啉单胞菌还分泌外毒素和酶，在它们释放后会对宿主造成损伤。这些酶包括蛋白酶、凝固酶和纤维蛋白溶酶。值得注意的是，牙龈卟啉单胞菌产生肽基精氨酸脱亚胺酶，其可以将游离的或肽结合的精氨酸修饰为瓜氨酸。瓜氨酸化蛋白质特别有害，因为它们会引起自身免疫应答，并被假设为类风湿性关节炎的罪魁祸首。此外，牙龈卟啉单胞菌还产生两种类型的牙龈蛋白酶、赖氨酸特异性(Kgp)和精氨酸特异性(Rgps)。牙龈蛋白酶在激活牙周组织中的炎症和组织破坏中起主要作用。