[发明专利]用于以高通量方式体内评估RNA引导的核酸酶的活性的方法

权利要求书

1.一种用于评估RNA引导的核酸酶的活性的方法，所述方法包括：

(a)使用从具有包含寡核苷酸的基因组的细胞文库获得的DNA进行序列分析，所述细胞文库中导入有RNA引导的核酸酶，其中，所述寡核苷酸包含编码引导RNA的核苷酸序列和所述引导RNA靶向的靶核苷酸序列，其中，将所述靶核苷酸序列人工设计为评估中靶活性或脱靶活性；以及

(b)由获得自所述序列分析的数据对各引导RNA-靶序列对的插入缺失频率进行检测。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述引导RNA包含CRISPR RNA(crRNA)。

3.如权利要求1所述的方法，其中，所述寡核苷酸包含原型间隔区邻近基序(PAM)序列。

4.如权利要求3所述的方法，其中，所述寡核苷酸在5’至3’方向或在反方向包含：编码引导RNA的序列、条形码序列、PAM序列和靶核苷酸序列。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述寡核苷酸还包含选自于由正向重复序列、多聚T序列、条形码序列、恒定序列、启动子序列和支架序列所组成的组中的至少一种。

6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述寡核苷酸由100个至200个核苷酸的序列组成。

7.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，存在于一个寡核苷酸中的引导RNA顺式作用于存在于相同寡核苷酸中的靶核苷酸序列。

8.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述方法包括：

(a)将RNA引导的核酸酶导入具有包含寡核苷酸的基因组的细胞文库中，其中，所述寡核苷酸包含编码引导RNA的核苷酸序列和所述引导RNA靶向的靶核苷酸序列，其中，将所述靶核苷酸序列人工设计为评估中靶活性或脱靶活性，其中，通过病毒载体将所述寡核苷酸导入所述基因组中；

(b)使用从导入RNA引导的核酸酶的细胞文库获得的DNA进行深度测序；以及

(c)由获得自所述深度测序的数据对各引导RNA-靶序列对的插入缺失频率进行检测。

9.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述RNA引导的核酸酶是Cas9蛋白或Cpf1蛋白。

10.如权利要求9所述的方法，其中，所述Cas9蛋白来源于选自于由如下微生物所组成的组中的至少一种微生物：链球菌(Streptococcus)属、奈瑟氏菌(Neisseria)属、巴斯德氏菌(Pasteurella)属、弗朗西斯氏菌(Francisella)属和弯曲杆菌(Campylobacter)属。

11.如权利要求9所述的方法，其中，所述Cpf1蛋白来源于选自于由如下微生物所组成的组中的至少一种微生物：Candidatus Paceibacter属、毛螺菌(Lachnospira)属、丁酸弧菌(Butyrivibrio)属、Peregrinibacteria属、氨基酸球菌(Acidominococcus)属、卟啉单胞菌(Porphyromonas)属、普雷沃氏菌(Prevotella)属、弗朗西斯氏菌属、CandidatusMethanoplasma属和真细菌(Eubacterium)属。

12.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述RNA引导的核酸酶的特征包括选自于由如下特征所组成的组中的至少一种：

(i)所述RNA引导的核酸酶的PAM序列；

(ii)所述RNA引导的核酸酶的中靶活性；或者

(iii)所述RNA引导的核酸酶的脱靶活性。

13.如权利要求1所述的方法，其中，所述序列分析通过深度测序进行。