[发明专利]预防蛋白质二硫键还原

说明书

本文披露了用于在含二硫键蛋白质的制造工艺期间测试谷胱甘肽系统组分和硫氧还蛋白系统组分的存在和/或活性的方法。还披露了用于减少制造工艺期间二硫键还原和降低含二硫键蛋白质的还原电位的方法。本文提供了用于在蛋白质制造工艺期间减少含二硫键蛋白质的还原并降低其还原电位的组合物、试剂盒和方法。

技术领域

本披露涉及单克隆抗体和所得产物变体的还原。本文披露了用于增加含完整二硫键的蛋白质产量的方法、用于减少含二硫键蛋白质的还原的方法、以及用于减少含二硫键蛋白质的还原电位的方法。

背景技术

单克隆抗体(mAb)能够以高亲和力和异常的特异性结合多种靶标。因此，已成功设计mAb以治疗多种疾病和病症，包括癌症、感染性疾病、自身免疫性疾病和炎症、心血管疾病和眼科疾病。临床上mAb的高成功率使其成为一类快速发展且日益重要的治疗方法。为了满足对这些救命分子日益增长的需求，已经投入大量精力来开发被设计用于增加抗体滴度同时保持一致产品质量的mAb的制造工艺。在过去的十年中，抗体滴度已经实现快速增加，目前的制造工艺产生大于10g/L的mAb。

许多蛋白质分子仅在形成稳定的分子间和分子内二硫键的情况下起作用，以正确地折叠和维持功能。这些蛋白质分子的实例是免疫球蛋白和含有免疫球蛋白结构域的细胞表面受体、核糖核酸酶、乳白蛋白、胰岛素、角蛋白、血球凝集素、病毒膜蛋白、神经内分泌蛋白7B2、表皮生长因子、雄性腺体激素、AP-1样转录因子YAP1、乙酰胆碱受体、树眼镜蛇毒素、骨形态发生蛋白2-A、绒毛膜促性腺激素、组蛋白H3、血小板反应蛋白1、disintegrinschistatin、snaclec botrocetin、乙酰胆碱酯酶胶原蛋白尾肽、蓝豆蛋白δ-2、氧化还原酶、硫化物脱氢酶和溶菌酶。标准抗体分子包括四条肽链，即两条重链和两条轻链。通过在四条链之间形成二硫键，这四条肽链在功能性抗体分子中正确地折叠在一起。抗体分子的肽链内形成的二硫键的数量根据抗体亚型而变化。

在制造期间可以发生含内部锚定二硫键蛋白质的二硫键的还原。早在2010年就针对制造免疫球蛋白报道了这个问题，并随后在整个行业范围内被观察到(Hutterer等人，2013,mAbs,5:608–613；和Kao等人，2010,Biotechnol.Bioeng.[生物技术生物工程],107:622–632)。链间二硫键的还原导致功能性抗体的丧失，并且需要更复杂的纯化过程以去除无活性的副产物(Mun等人，2014,Biotechnol.Bioeng.[生物技术生物工程],112(4):734-742)。在mAb工艺开发期间，必须将片段和聚集体去除至足够的水平，因为它们具有与增加的免疫原性相关的风险和对药物功效的未知影响。此外，这些杂质的存在还会影响产品在储存期间的稳定性，导致保质期缩短。

蛋白质或多肽的片段化可能由产物不稳定性(Cordoba A.等人，2005,J.Chrom.B.[色谱法杂志B卷],818(2):115-21)或通过细胞中存在的宿主细胞蛋白(HCP)的蛋白水解活性(Gao等人，2011,Biotechnol.Bioeng.[生物技术生物工程]108(4):977-982)引起，而聚集可以在制造工艺期间和之后的各个步骤(例如在细胞培养、收获、纯化、冻融、装瓶(vialing)和储存期间)发生。通常在工艺开发期间实施策略，以改善这两种产品质量属性。这些包括：优化生物反应器条件以防止细胞培养期间的片段化或聚集体形成；优化收获条件以使细胞裂解最少化(Hutchinson N.等人，2006,Biotechnol.Bioeng.[生物技术生物工程],95(3):483-491)；在纯化过程(例如离子交换、疏水相互作用和混合模式)中结合色谱抛光(polishing)步骤以从目的产物中分离杂质；和配制品开发过程中的赋形剂筛选，以使分子保质期期间的聚集和片段化最少化。