[发明专利]polX家族的DNA聚合酶的变体

说明书

本发明涉及能够在没有模板链的情况下合成核酸分子的polX家族的DNA聚合酶的变体或该聚合酶的功能片段的变体以及所述变体的用途，特别是用于合成包含3'‑OH‑修饰的核苷酸的核酸分子的用途，所述变体包含在至少一个特定位置处的残基的至少一个突变。

引言

本发明属于酶增强领域。本发明涉及polX家族的DNA聚合酶的增强型变体，编码所述变体的核酸，所述变体在宿主细胞中的产生，所述变体用于在没有模板链的情况下合成核酸分子的用途，和用于在没有模板链的情况下合成核酸分子的试剂盒。

核酸片段的化学合成是在实验室中广泛使用的技术(Adams等人,1983,J.Amer.Chem.Soc.105:661；Froehler等人,1983,Tetrahedron Lett.24:3171)。该技术能够快速产生包含所期望核苷酸序列的核酸分子。与在5'至3'方向上进行合成的酶不同，化学合成发生在3'至5'方向上。然而，化学合成具有某些缺陷。事实上，化学合成要求使用多于一种(multiple)溶剂和试剂。另外，仅能获得短核酸片段，然后必须对其进行组装以获得所期望的最终核酸链。

已经开发了替代性解决方案，其使用能够从初始核酸片段(引物)且在不存在模板链的情况下进行核苷酸之间的偶联反应的酶。数种聚合酶似乎适合于此类合成方法。

存在能够在有或没有模板链的情况下催化核酸链的合成的非常大量的DNA聚合酶。例如，polX家族的DNA聚合酶特别地以DNA修复机制或对DNA序列中出现的错误的校正机制参与广泛的生物学过程。这些酶能够将核苷酸引入已经历了在序列中的错误被鉴定之后的切除的核酸链。polX家族的DNA聚合酶包括DNA聚合酶β(Polβ)、λ(Polλ)、μ(Polμ)、来自酵母的IV(Pol IV)和末端脱氧核糖核苷转移酶(TdT)。特别是TdT被广泛用于酶促合成核酸分子的方法。

然而，这些DNA聚合酶通常仅允许掺入天然核苷酸。在所有情况下，在非天然核苷酸特别是3'OH-修饰的核苷酸的存在下天然DNA聚合酶失去其催化活性，3'OH-修饰的核苷酸具有比天然核苷酸大的空间体积。

然而，修饰的核苷酸的使用对于某些特定应用可能是有用的。因此，有必要开发能够催化通过掺入此类核苷酸来合成核酸链的酶。因此开发了DNA聚合酶的变体，目的是使用含有显著结构修饰的核苷酸。

然而，目前可得的变体并不完全令人满意，特别是由于它们的低活性，仅与实验室规模的酶促合成相容。因此，如果可能的话，对于能够在在工业规模上、在不存在模板链的情况下并使用修饰的核苷酸合成核酸的DNA聚合酶存在需求。

发明概述

本发明消除了某些技术障碍，这些技术障碍妨碍了DNA聚合酶在工业规模用于核酸的酶促合成。

因此，本发明提出了能够在模板链的不存在下合成核酸并且可以使用修饰的核苷酸的polX家族的DNA聚合酶的变体。开发的变体具有修饰的核苷酸的掺入能力，远远优于它们所源自的天然DNA聚合酶的修饰的核苷酸的掺入能力。特别地，本发明涉及的DNA聚合酶的变体对于掺入具有糖修饰的核苷酸特别有效。事实上，本发明人开发了与其所源自的DNA聚合酶的催化口袋体积相比具有增加的催化口袋体积的变体，所述变体促进了比天然核苷酸体积大的修饰的核苷酸的掺入。更准确地说，本发明涉及的polX家族的DNA聚合酶的变体包含氨基酸的至少一个突变，所述突变直接在酶的催化腔处干预或允许该腔的轮廓变形以便适应由于核苷酸中存在的修饰而变化的空间体积。例如，引入的突变使得扩大修饰的核苷酸的3′–OH末端所适合的酶的催化腔是可能的。可选地或另外地，所产生的突变使得可能使催化腔的体积膨大或增加，以增加3'-OH-修饰的核苷酸对催化口袋的接近和/或以赋予酶结构必要的柔性以允许其适应3'-OH-修饰的核苷酸的空间上显著的改变。由于此类突变，在聚合酶与待延长的核酸片段结合后，修饰的核苷酸进入催化口袋(其进入部位(access)被扩大)的核心并采取最佳空间构象，在核酸链的最后一个核苷酸的3'-OH末端与修饰的核苷酸的5'-三磷酸末端之间产生磷酸二酯键。