[发明专利]通过使用核酸酶来进行人神经干细胞的基因组编辑

权利要求书

1.用于产生经遗传修饰的人神经干细胞的方法，所述方法包括：

向分离的人神经干细胞中引入：

(a)供者模板，其包含：(i)包含转基因的转基因盒；和(ii)两个包含安全港座位的两个非重叠的同源部分的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于所述转基因盒的5’和3’末端处；和

(b)DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列，其中所述DNA核酸酶能够在所述安全港座位中产生双链断裂以诱导所述转基因插入到所述安全港座位中，由此产生经遗传修饰的人神经干细胞。

2.权利要求1的方法，其中所述DNA核酸酶选自由下列各项组成的组：CRISPR-相关蛋白(Cas)多肽、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、兆碱基大范围核酸酶、其变体、其片段和其组合。

3.权利要求1或2的方法，其中所述分离的人神经干细胞包含初级神经干细胞。

4.权利要求1或2的方法，其中所述分离的人神经干细胞源自体干细胞或多能干细胞，或通过直接重编程而源自体细胞群体。

5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述转基因编码与中枢神经系统的遗传病症相关的蛋白质。

6.权利要求5的方法，其中所述蛋白质由从由下列各项组成的组中选择的基因编码：GALC(克拉伯病)、ABCD1(肾上腺脑白质营养不良)、GFAP(亚历山大病)、CYP27A1(脑腱黄瘤病)、ARSA(异染色性脑白质营养不良)、PLP1(佩-梅病)、ASPA(卡纳万病)、EIF-2B(具有正在消失的白质的白质脑病)、PHYH(雷夫叙姆病1)、PEX7(雷夫叙姆病2)、PPT1(婴儿神经细胞蜡样质脂褐素病(NCL))、TPP1(晚期婴儿NCL)、CLN3(青少年NCL)、CLN6(成人NCL)、CLN5(芬兰晚期婴儿变异型NCL)、CLN6(晚期婴儿变异型NCL)、MSFD8(神经细胞蜡样质脂褐素病7)、CLN8(神经细胞蜡样质脂褐素病8)、CTSD(神经细胞蜡样质脂褐素病10)、UBE3A(安格尔曼综合征)、POLG(阿尔珀斯病)、TAZ(巴尔特综合征)、GLA(法布里病)、SLC20A2(法尔氏综合征)、PDE(色素性视网膜炎)、SMN1(脊髓性肌萎缩)、IKBKAP(家族性自主神经功能异常)、MeCP2(雷特综合征)、CACNA1C(蒂莫西综合征)、ATXN3(马-约病)和RPE65(莱伯先天性黑矇)。

7.权利要求5或6的方法，其中所述蛋白质由所述经遗传修饰的人神经干细胞分泌。

8.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述转基因编码神经保护性或神经再生性蛋白质、其变体、其片段或其肽模拟物。

9.权利要求8的方法，其中所述神经保护性或神经再生性蛋白质选自由下列各项组成的组：脑源性神经营养因子(BDNF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、胶质源性神经营养因子(GDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-2(NT-2)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4/5(NT-4/5)、神经营养蛋白-6、保守型多巴胺神经营养因子(CDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、集落刺激因子(CSF)、干扰素-β(IFN-β)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、neurturin、persephin、artemin、神经肽Y(NPY)、肝配蛋白、脑信号蛋白、其他神经生成因子、其他神经营养因子和其组合。

10.权利要求8的方法，其中所述神经保护性或神经再生性蛋白质为分泌型蛋白质。

11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述供者模板包含异源启动子。