[发明专利]一种基于荧光能量转移的单分子/集群DNA合成测序

权利要求书

1.一种具有以下结构的核苷酸类似物：

其中碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶或它们的衍生物，其中X是CH₂、NH、CHF或CF₂，其中n是0、1、2、3或4，其中受体染料是荧光团。

2.根据权利要求1所述的核苷酸类似物，其中所述受体染料是2个或3个荧光团。

3.根据权利要求1或2所述的核苷酸类似物，其中所述荧光团是花青染料、罗丹明染料、荧光素、吖啶、香豆素、德克萨斯红染料、BODIPY、GFP、rhodol、ROX、resorfuin、AlexaFlour、Tokyo Green或多种前述物质。

4.一种确定单链DNA中的核苷酸的身份的方法，其包括：

a)使包含具有与其一部分杂交的引物的单链DNA的组合物与核苷酸聚合酶和具有以下结构的核苷酸类似物接触：

其中碱基为A、C、G、T或U或它们的类似物，其中X为CH₂、NH、CHF或CF₂，其中n为0、1、2、3或4，其中受体染料是一个或多个荧光团，其中X防止核苷酸聚合酶水解α磷酸酯和β磷酸酯之间的键，

所述接触在下述条件下进行：如果核苷酸类似物的碱基与单链DNA中在5'方向上紧挨着单链DNA中与引物的3'末端核苷残基杂交的核苷酸残基的核苷酸残基互补，则允许核苷酸聚合酶与单链DNA、引物和所述核苷酸类似物形成三元复合物，

其中DNA聚合酶具有连接的、并入的和/或缀合的荧光供体分子，其中供体分子是福斯特共振能量转移(FRET)供体，核苷酸类似物上的受体染料是相应的FRET受体，

其中如果核苷酸类似物的碱基不与单链DNA中在5'方向上紧挨着单链DNA中与引物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷残基的核苷酸残基互补，则反复地重复与不同的核苷酸类似物接触，直至核苷酸类似物与单链DNA中在5'方向上紧挨着单链DNA中与引物的3'末端核苷酸残基杂交的核苷残基的核苷酸残基互补，从而形成三元复合物，

条件是(i)每种核苷酸类似物上的碱基类型不同于每种其他核苷酸类似物上的碱基类型，和(ii)每种核苷酸类似物荧光团的受体染料具有预定的荧光波长发射；

b)使用适当的光谱发射激发DNA聚合酶供体荧光分子，从而使相应的FRET受体产生预定的荧光波长发射，从而确定核苷酸类似物的身份，其中所述相应的FRET受体是与所述三元复合物中的核苷酸类似物连接的受体染料有机荧光团。