[发明专利]治疗性重组KLOTHO蛋白及其组合物和方法

权利要求书

1.一种制备重组Klotho蛋白的方法，所述方法包括：

在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生重组Klotho蛋白，

优选在二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型CHO细胞中，更优选在CHO-S细胞中，或

优选在谷氨酰胺合成酶(GS)缺陷型CHO细胞中，更优选在GS-/-CHO细胞中，

所述蛋白质优选地与SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：70之一具有至少85％的氨基酸序列同一性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质包含与其连接的一种或多种聚糖。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述CHO细胞含有外源核酸，其编码：

启动子，优选强启动子；

与SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：70之一具有至少85％氨基酸序列同一性的多肽；和

任选地，功能性二氢叶酸还原酶(DHFR)酶或功能性谷氨酰胺合成酶(GS)酶，

其中产生所述重组Klotho蛋白包含表达由所述核酸编码的所述多肽。

4.根据权利要求3所述的方法，还包括选自以下的一个或多个步骤：

将所述外源核酸导入所述CHO细胞，优选通过转染；和

在液体培养基中培养CHO细胞，优选在无血清和/或无动物蛋白成分的培养基中，其中所述液体培养基优选包含碳源、氮源和一种或多种维生素、矿物质、盐、氨基酸、补充剂或添加剂，更优选其中所述液体培养基缺乏次黄嘌呤、胸苷和/或谷氨酰胺。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述蛋白质从CHO细胞分泌到液体培养基中，优选浓度为每升液体培养基200-500mg蛋白质，更优选浓度为500-2000mg蛋白质，更优选浓度为2000-5000毫克蛋白质，而不浓缩蛋白质。

6.根据权利要求4所述的方法，还包括将有效量的甲氨蝶呤(MTX)和/或甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)引入液体培养基中，优选浓度为约1nM-1μM，更优选浓度为约10μM-100nM。

7.根据权利要求4所述的方法，还包括选择在液体培养基中生长的活CHO细胞的悬浮培养物，其中所选悬浮培养物的培养基中蛋白质的浓度为在不浓缩蛋白质的情况下，至少200mg/L、优选至少500mg/L、更优选至少1000mg/L、甚至更优选至少2000mg/L、还更优选至少5000mg/L。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所选择的悬浮培养物的活CHO细胞含有至少约2至10个拷贝、优选至少约10至20个拷贝、更优选至少约20至30个拷贝、甚至更优选至少约30至50个拷贝的外源核酸/细胞。

9.根据权利要求4所述的方法，进一步包括从CHO细胞、液体培养基或两者中纯化含有重组Klotho蛋白的提取物，所述提取物优选包含：

至少约98％干重的所述蛋白质；和/或

小于约1-100ppm的CHO宿主细胞蛋白(HCP)。

10.根据权利要求9所述的方法，其中纯化提取物维持蛋白质的糖基化。

11.根据权利要求4所述的方法，其中生长所述CHO细胞包括在生物反应器中培养CHO细胞，所述生物反应器的体积或工作体积为至少10升，优选至少25升，更优选至少50升，甚至更优选至少100升，还更优选至少250升，还更优选至少500升，还更优选至少1,000升，还更优选至少2,000升，还更优选至少2500升，还更优选至少5,000升，还更优选至少10,000升。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述核酸包含转基因或cDNA，其与SEQ ID NO：76至SEQ ID NO：96之一优选地具有至少85％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％、仍甚至更优选至少98％、还更优选至少99％、最优选100％核酸序列同一性。