[发明专利]用于纯化生物大分子复合物的方法

说明书

本发明在第一方面涉及用于纯化生物大分子复合物的方法。通常来说，未应用色谱步骤。即，本发明涉及用于纯化生物大分子复合物的方法。此外，本发明涉及用于使生物大分子复合物结晶的方法，其包括所述纯化的步骤，然后在包含水溶性聚合物的储库溶液中结晶。此外，提供了可通过根据本发明方法获得的经纯化生物大分子复合物以及结晶的生物大分子复合物。最后，提供了用于确定候选化合物用于抑制个体之20S蛋白酶体的适合性的方法。所述方法特别地可用于在个体中鉴定20S蛋白酶体之合适抑制剂的用于治疗、改善或预防癌症、自身免疫病、肌营养不良、肺气肿或伴随癌症或AIDS之恶病质的个体化医疗。

本发明在第一方面涉及用于纯化生物大分子复合物的方法。通常来说，其中未应用色谱步骤。即，本发明涉及用于纯化生物大分子复合物的方法，其包括以下步骤：a)提供包含所述生物大分子复合物的粗制样品；b)以25，000至35，000×g进行用于分离细胞碎片的第一离心步骤；c)向从所述第一离心步骤获得的上清液补充0％至25％(w/v)之量的渗压剂(osmolyte)和允许半胱氨酸发生巯基烷基化的化合物；d)通过以50，000至150，000×g(例如80，000至120，000×g)离心进行第二离心步骤；e)用水溶性聚合物(特别是非离子聚合物或具有零净电荷的聚合物，例如聚亚烷基二醇、多胺或聚羧酸盐/酯)处理从所述第二离心步骤获得的上清液，用于沉淀；f)在沉淀物重悬于不含所述聚合物(例如聚亚烷基二醇)的缓冲液中之后，使用渗压剂与基于所述聚合物的沉淀物(例如基于聚亚烷基二醇的沉淀物)进行密度梯度离心；g)任选地重复步骤e)和f)一次或多次；h)通过对所述生物大分子复合物进行基于水溶性聚合物的沉淀(例如基于聚亚烷基二醇的沉淀)来进行浓缩；用于获得经纯化的生物大分子复合物。

此外，本发明涉及用于使生物大分子复合物结晶的方法，其包括所述的纯化步骤，然后在包含水溶性聚合物的储库溶液(reservoir solution)中结晶。此外，提供了可通过根据本发明方法获得的经纯化生物大分子复合物以及结晶的生物大分子复合物。最后，提供了用于确定候选化合物用于抑制个体之20S蛋白酶体(包括免疫蛋白酶体)的适合性的方法。所述方法特别地可用于在个体中鉴定20S蛋白酶体(包括免疫蛋白酶体)之合适抑制剂的用于治疗、改善或预防癌症、自身免疫病、肌营养不良、肺气肿或伴随癌症或AIDS之恶病质的个体化医疗(personalized medicine)。

现有技术

对于许多生物化学需要，希望能够从分子混合物中分离特定分子用于进一步分析。这包括例如从细胞提取物中纯化蛋白质或其他生物分子；从污染物中纯化合成的化学物质或分离化学混合物，特别是生物大分子复合物。大分子复合物(例如生物大分子复合物)是超分子组装体或相同的部分。例如，生物大分子复合物是相同或不同生物分子甚至不同类型生物分子的组装体。这样的生物分子包括蛋白质、核酸、脂质和糖。通常来说，生物大分子复合物在存在于天然环境(例如活生物体)中的特定条件下形成。所述生物大分子复合物对于活生物体的存活至关重要，并且在多种生化途径中具有关键功能。在机理上理解这些生物大分子复合物如何进行其任务的关键是了解它们的三维结构。然而，研究生物大分子复合物的结构、特别是所述生物大分子复合物的功能的一个主要障碍是其组成复杂性，并且基于此，所述结构通常相对不稳定，特别是当从自然环境中分离时。也就是说，当重组表达或合成产生时，在纯化过程中难以实现大分子组装体的结构确定和正确形成。特别地，当分离和纯化生物大分子复合物时，目标是提供处于功能状态并且结构稳定的经纯化生物大分子复合物。正在进行的生物科学研究显示，大分子通常不是孤立地发挥作用，而是组织成超分子组装体。这些被称为生物大分子复合物或分子机器(molecular machine)的模块是进行维持细胞稳态所必需的生化反应的活性物质。分子机器或生物大分子复合物(在下文中称为生物大分子复合物或通常称为复合物)可分为三大类：仅由蛋白质构成的那些、由蛋白质和核酸组成的那些以及整合膜复合物。

也就是说，为了能够确定三维结构以获得细胞内各作用方式的内部机理，需要提供稳定且完全功能的生物大分子复合物。