[发明专利]蛋白质在具有0.5:1至10:1的周质体积与细胞质体积比的革兰氏阴性菌中的表达

说明书

提供了具有增加的周质体积的经修饰的革兰氏阴性菌。还提供了在细菌中表达外源基因并将蛋白质导向至周质间隙进行产生的方法。

发明背景

技术领域

本发明涉及具有增加的周质体积的经修饰的革兰氏阴性菌，以及其中表达外源基因的方法。这些细菌可用于将重组蛋白导向至周质间隙进行产生。

背景技术

尽管长期努力优化原核表达系统，仍然存在许多障碍以获得足够产量的功能活性基因产物，包括包涵体的形成、表达蛋白的不正确折叠、对生产细胞的毒性和蛋白酶的降解。正在开发和评估多种替代表达系统以更有效地产生重组蛋白。

大肠杆菌是最常用于产生重组蛋白的宿主。然而，为了获得在重组大肠杆菌中细胞内表达的靶外源蛋白，细胞破碎是必要的，其可以增加热原水平(主要来自细胞膜组合物)，增加样品杂质并降低蛋白质活性。特别地，当靶蛋白在细胞内过量表达时，经常发生包涵体的形成。为了克服这些问题，重组大肠杆菌中外源蛋白的细胞外分泌正成为越来越受欢迎的选择。在外源蛋白的大规模工业化生产中，靶蛋白的细胞外分泌可以去除细胞破碎的步骤，为蛋白质折叠提供更好的环境并降低细胞内酶降解的风险(Mergulhao等人，2005，Biotechnol Adv[生物技术的进步]23:177-202)。另外，靶蛋白的细胞外分泌可以提高重组蛋白的产量，因为靶蛋白的积累不限于周质或细胞内空间(Makrides，1996，Microbiol Rev[微生物学评论]60:512-538；Fu等人，2005，Biotechnol Prog[生物技术进展]21:1429-1435)。

细胞外分泌重组蛋白的主要挑战是跨越细胞膜和大肠杆菌细胞外膜的蛋白质易位所固有的困难(Koebnik等人，2000，Mol Microbiol[分子微生物学]37:239-253；Choi和Lee，2004，Appl Miccrobiol Biotechnol[应用微生物学与生物技术]64:625-635)。虽然通常可以借助信号肽实现重组蛋白的周质表达，但是克服用于细胞外产生重组蛋白的外膜屏障的可用方法是更加有限的。为了解决这个问题，已经进行了各种遗传尝试以促进重组蛋白在大肠杆菌中的细胞外分泌，包括运输途径的操作(Sugamata和Shiba，2005，ApplEnviron Microbiol[应用环境微生物学]71:656-662)、密码子和信号序列的优化(Takemori等人，2012，Protein Expr Purif[蛋白质表达与纯化]81:145-150)、载体蛋白(其通常可以在细胞外分泌)的融合表达(Fernandez等人，2000，Appl Environ Microbiol[应用环境微生物学]66:5024-5029；Choi和Lee，2004)以及外膜蛋白F(Jeong和Lee，2002，Appl Environ Microbiol[应用环境微生物学]68:4979-4985)、YebF(Zhang等人，2006，NatBiotechnol[自然生物技术]24:100-104)或渗透诱导蛋白Y(Qian等人，2008，BiotechnolBioeng[生物技术与生物工程]101:587-601)的融合表达。另外，还报道了裂解促进蛋白如细菌素释放蛋白(BRP)(van der Wal等人，1995，Appl Microbiol Biotechnol[应用微生物学与生物技术]44:459-465)或大肠杆菌素E1裂解蛋白(Kil)(Robbens等人，1995，ProteinExpr Purif[蛋白质表达与纯化]6”481-486)的共表达以及无壁菌株(所谓的L-形式)(Gumpert和Hoischen，1998，Current Opinion in Biotechnology[生物技术新观点]9:506-509)的用途。