[发明专利]用于在植物中产生突变的工程化核酸酶

说明书

提供了使用双链DNA断裂诱导酶以靶向方式使植物细胞基因组突变的方法。还提供了产生的种子产生饱和脂肪酸总含量降低的油的植物，尤其是芸苔属植物，及培育此类植物的方法。

优先权

本申请要求2016年5月25日提交的美国临时专利申请序列号62/341,489的优先权权益，该临时专利申请通过引用并入本文。

发明背景

近年来，已经将高饱和脂肪含量的饮食与胆固醇水平升高和冠心病风险增加联系在一起。同样，目前的膳食指南表明饱和脂肪摄入量不应超过总热量的10％。基于每天2,000卡路里的饮食，这是每天约20克饱和脂肪。油含有饱和脂肪。例如，菜籽油通常含有约7％至8％的饱和脂肪酸。饱和脂肪酸含量的降低将会改善油的营养特征(nutritionalprofile)。

发明概要

参与植物油合成的基因，包括调节饱和脂肪酸和油酸含量的基因，已经通过涉及将种子暴露于化学药品或辐射以便产生具有所需性状的突变体的过程进行突变。与用工程化核酸酶修饰的植物不同，其中突变(取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸)可以工程化为出现在植物基因组中的非常特定的位置，通过诱变过程开发的植物常常产生随机的、多种非特异性遗传变化。这些随机的、多种遗传变化全部汇集在一起，以提供突变植物的表型。用工程化核酸酶，可以产生非常特定的突变或一组突变，并且可以确定它们对表型(例如，油特征(oil profile))的影响。

本文提供了突变体FatA1、FatA2、Kas2、Kas3和/或FatB的产生，通过使用工程化核酸酶产生的等位基因，包含FatA1、FatA2、Kas2、Kas3和/或FatB的所述一个或多个突变等位基因的植物，诸如芸苔属(Brassica)植物，以及此类产生较低饱和脂肪酸含量的植物的用途。如本文所述，含有此类突变的芸苔属植物可以产生饱和脂肪酸含量降低的油。本文所述的芸苔属植物对生产用于某些食品应用的菜籽油特别有用，因为所述植物未经基因修饰。

本文提供了通过工程化核酸酶在FatA1、FatA2、Kas2、Kas3和/或FatB的一个或多个等位基因中包括取代、缺失和/或插入突变的芸苔属植物(例如，甘蓝型油菜(Brassicanapus)、芥菜(Brassica juncea)或芜菁(Brassica rapa)植物)及其后代(例如种子)，其中每个突变等位基因均导致产生相对于相应的野生型FatA1、FatA2、Kas2、Kas3和/或FatB多肽活性降低或没有活性的FatA1、FatA2、Kas2、Kas3和/或FatB多肽(或者所述取代、缺失和/或插入可导致不产生FatA1、FatA2、Kas2、Kas3和/或FatB蛋白/活性)。突变等位基因可包括编码截短的FatA1、FatA2、Kas2、Kas3和/或FatB多肽的核酸。突变等位基因可包括与野生型等位基因的核苷酸序列(例如，FatA1的SEQ ID NO:1)具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。

一个实施方案提供了一种产生饱和脂肪酸减少的植物的方法，其包括：a)使植物与对FatA1、FatA2、Kas2、Kas3和/或FatB基因具有特异性的工程化核酸酶接触；b)使来自步骤a)的植物生长并从所述植物收集种子；并且c)选择由步骤b)的在一个或多个所述基因中具有取代、缺失和/或插入突变的种子生长的植物；其中其中所述取代、缺失和/或插入突变导致与未通过所述基因编辑突变的相同遗传背景的对照植物相比，所述植物的饱和脂肪酸产量减少。

另一个实施方案提供了一种产生饱和脂肪酸减少的植物的方法，其包括：a)使植物细胞或组织与对FatA1、FatA2、Kas2、Kas3和/或FatB基因具有特异性的工程化核酸酶接触；b)由步骤a)的植物细胞或组织产生植物；c)选择由步骤b)的在一个或多个所述基因中具有取代、缺失和/或插入突变的种子生长的植物；其中其中所述取代、缺失和/或插入突变导致与未通过所述基因编辑突变的相同遗传背景的对照植物相比，所述植物的饱和脂肪酸产量减少。