[发明专利]高效表达重组人血清白蛋白工程菌的构建

说明书

本发明提供了一种高效表达重组人血清白蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：在酵母宿主细胞中，将(a)人血清白蛋白基因与(b)一种或多种rHSA表达促进因子基因进行共表达。

技术领域

本发明涉及人血清白蛋白的重组生产，具体而言，本发明涉及通过在酵母细胞中共表达人血清白蛋白与一种或多种人血清白蛋白表达促进因子来高效生产人血清白蛋白的方法。

背景技术

人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)是人血中含量最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白含量约60％，具有重要的生理功能，可维持血液渗透压，是运输内源性及外源性物质的重要载体和重要的血液缓冲组分。此外，HSA还可以作为细胞培养基的添加成分、药物辅料等，具有重要应用价值。目前，HSA的来源主要有两种：一种是从血浆中提取，由于国内血浆紧缺以及存在艾滋病、肝炎等病毒感染的风险，该方法获得的HSA无法满足巨大的市场需求；另一种是利用生物工程技术进行重组制备。利用生物工程技术重组制备的人血清白蛋白叫做重组人血清白蛋白(Recombinant Human Serum Albumin，rHSA)。其中，酵母表达rHSA技术研究得最广泛、最成熟。专利US 5683893公开了一种对毕赤酵母醇氧化酶(Alcohol oxidase，AOX)启动子进行突变的方法，增强了rHSA在酵母中的表达。2005年4月29日提交的中国专利申请200510068171.9公开了一种rHSA酵母菌株构建及发酵方法，表达量可以达到10g/L培养基上清。但是，上述方法仍然存在rHSA表达量较低、发酵时间长、生产效率低等缺陷，需要寻找新的方法构建更加高产的工程菌株。

毕赤酵母(Pichia)具有真核生物蛋白翻译后修饰功能，使得外源蛋白在表达后能够正确折叠、组装并分泌到胞外。同时，毕赤酵母能有效利用甲醇作为单一碳源进行高密度发酵。因此，毕赤酵母已经广泛用于外源蛋白的表达。但是，毕赤酵母的发酵周期一般较长、生产成本高，并且容易发生污染及蛋白降解。所以，缩短发酵时间、降低成本成为该表达体系的研究热点。

酵母内质网(Endoplasmic reticulum，ER)是蛋白质折叠成天然构象、进行糖基化和磷酸化等后修饰的重要场所。当内质网中存在大量未折叠蛋白时，会诱发未折叠蛋白应答效应(unfolded protein response，UPR)，进而激活下游分子伴侣、折叠酶的表达以及内质网相关的蛋白质降解途径。作为自身调节机制，UPR对酵母生长及分泌蛋白的表达具有重要的作用(Graham Whyteside,et al.FEBS Letters 2011；585:1037-1041)。转录激活因子HAC1(Transcriptional activator HAC1)作为酵母UPR的调控因子，能够调控与UPR相关的一系列蛋白质的表达，包括结合蛋白KAR2(Binding protein KAR2)、蛋白质二硫键异构酶(Protein disulfide-isomerase，PDI)、内质网氧化还原酶(Endoplasmic reticulumoxidoreductin-1，ERO1)、脯氨酸顺反异构酶(Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase，PPI)等，它们在帮助目的蛋白质表达与分泌的过程中发挥着重要的作用。2013年3月22日提交的中国专利申请201310095971.4公开了一种将PDI与黑曲霉α-葡萄糖苷酶共表达的方法，增加了目的蛋白的表达量。2007年5月16日提交的中国专利申请200780026864.9公开了一种增强甲醇同化酵母(Ogataea minuta)HAC1表达的方法，获得的工程菌株有较高的蛋白分泌能力。Tiziana Lodi等报道在乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)中，ERO1能有助于rHSA的分泌(Tiziana Lodi.et al.AEM 2005；71:4359-4363)。此外，在毕赤酵母中共表达KAR2使人源单链抗体片段(A33scFv)的表达量提高了两倍(Leonardo M.Damasceno,etal.Appl Microbiol Biotechnol,2007；74:381-389)。

发明内容