[发明专利]核酸序列测定方法

权利要求书

1.一种确定测试核苷酸是否是下一个正确的核苷酸的方法，所述下一个正确的核苷酸包含与紧邻引物模板核酸中的引物下游的模板链中的下一个碱基互补的碱基，所述方法包括以下步骤：

(a)使所述引物模板核酸与包含受损DNA聚合酶和所述测试核苷酸的第一反应混合物接触，

从而如果所述测试核苷酸是下一个正确的核苷酸，那么形成包含所述引物模板核酸、所述受损DNA聚合酶和所述测试核苷酸的复合物，且

其中所述受损DNA聚合酶在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的基序A中包含含有SEQ ID NO:12的多肽序列或在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的基序C中包含含有SEQ ID NO:14的多肽序列，且

其中所述受损DNA聚合酶不能实现镁催化的磷酸二酯键形成；

(b)测量在所述测试核苷酸存在下所述引物模板核酸与所述受损DNA聚合酶的结合，而所述测试核苷酸不会化学掺入到所述引物模板核酸的引物中；以及

(c)由步骤(b)的结果确定所述测试核苷酸是否是下一个正确的核苷酸。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述受损DNA聚合酶在二价锰离子存在下催化磷酸二酯键的形成，且其中所述第一反应混合物不含促进磷酸二酯键形成的浓度的二价锰离子。

3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述测试核苷酸包含外源性标记。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述测试核苷酸的外源性标记包含荧光部分，且其中步骤(b)包括测量由所述测试核苷酸的荧光部分产生的荧光信号。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述受损DNA聚合酶包含外源性标记，且其中步骤(b)包括检测所述受损DNA聚合酶的外源性标记。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述受损DNA聚合酶的外源性标记包含荧光部分，且其中步骤(b)包括测量由所述受损DNA聚合酶的荧光部分产生的荧光信号。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述引物包含游离的3’羟基部分。

8.如权利要求1所述的方法，其在步骤(b)之后还包括以下步骤：用包含第二聚合酶和第二类型的核苷酸的第二反应混合物替代所述第一反应混合物，接着将所述第二类型的核苷酸掺入到所述引物模板核酸的引物中。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述第二类型的核苷酸是包含可逆终止部分的可逆终止核苷酸，且其中所述可逆终止核苷酸的掺入产生封端的引物模板核酸分子。

10.如权利要求9所述的方法，还包括从所述封端的引物模板核酸分子中除去所述可逆终止部分以再生所述引物模板核酸分子的步骤。

11.如权利要求9所述的方法，还包括使用所述封端的引物模板核酸分子代替所述引物模板核酸重复步骤(a)-(c)。

12.如权利要求10所述的方法，还包括重复步骤(a)-(c)。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述受损DNA聚合酶的多肽序列是基于SEQ ID NO：1的具有被谷氨酸取代的氨基酸位置381的多肽序列；或基于SEQ ID NO：1的具有被谷氨酸取代的氨基酸位置558的多肽序列。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述受损DNA聚合酶的多肽序列是基于SEQ ID NO：2的具有被谷氨酸取代的氨基酸位置364的多肽序列；或基于SEQ ID NO：2的具有被谷氨酸取代的氨基酸位置541的多肽序列。