[发明专利]大量细胞培养系统、该系统所使用的容器间细胞液移送装置以及旋转细胞培养装置

说明书

本发明提供一种大量细胞培养系统、该系统所使用的容器间细胞液移送装置以及旋转细胞培养装置，即使在不存在饲养细胞或包被剂的情况下，也能够将在再生医疗等中使用的多能干细胞、特别是iPS细胞维持未分化性并进行大量培养，能够排除因操作者技能而引起的差异地进行传代培养，并且，还能够在悬浮状态下培养黏附性细胞。该系统是使用注射器构造的容器在密闭体系中进行传代培养以及细胞团与培养液的转移从而大量培养细胞的大量细胞培养系统，容器在外筒部的两端一体地设有外形为相同圆形的前凸缘和后凸缘，利用能够拆装的帽塞塞住头部，在将细胞悬浮在培养液中而形成的细胞液填充在由柱塞的垫圈所围成的空间内的状态下，能够利用前凸缘和后凸缘进行旋转培养。

技术领域

本发明涉及适合于大量培养在再生医疗等中使用的多能干细胞和黏附性细胞的大量细胞培养系统、该系统所使用的容器间细胞液移送装置以及旋转细胞培养装置。

背景技术

由于人工多能干细胞(本说明书中常称作“iPS细胞”)的发现(非专利文献1～3)，利用该人工多能干细胞的在再生医疗中的实用化的时机越来越成熟。对于iPS细胞在再生医疗等中的应用而言，在实验室中所使用的细胞数10⁶个左右的量绝对是不够的，在临床应用上需要10⁹～10¹⁰数量级的细胞数，但是，其大量培养技术尚未完全建立。另外，在iPS细胞的情况下，通常为了保持未分化状态地进行培养，必须在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)或STO细胞等饲养细胞上进行培养，但是，在用于再生医疗时，饲养细胞的混入成为很大的障碍。

因此，也在进行无饲养条件下的细胞培养方法的研究，通过在用基质胶包被的基材表面上培养iPS细胞的方法、或者利用层粘连蛋白或层粘连蛋白的部分肽进行的包被的培养方法，开发出即使不存在饲养细胞也能够进行培养的方法。另外，还进行着不使用通常的培养皿、而是使用培养袋的培养。但是，即使在无饲养的条件下能够培养的体系中，也必须在经过包被的基材上反复进行培养，因此，培养工序复杂，而且培养所花费的成本明显增多，存在用于治疗一名患者所需的费用极高这样的严峻的问题。另一方面，在黏附性细胞的情况下，需要在培养后添加药剂将附着细胞剥离，同样在用于再生医疗中时药剂的混入成为问题。

但是，在由细胞开始进行三维组织构建的情况下，通常需要使用适当的基础材料进行三维培养或者进行搅拌培养。但是，在现有的搅拌培养中，对细胞造成的机械刺激和损伤强，难以获得大的组织，或者即使得到了大的组织，多数情况下内部也会发生坏死。针对这种情况，存在为了使重量最优化而设计的一系列的生物反应器。其中之一的RWV(Rotating Wall Vessel，旋转壁式反应器)生物反应器是NASA开发的具备气体交换功能的旋转式生物反应器。本发明的发明人以前对于由使用该RWV生物反应器的三维培养得到的骨髓细胞等进行软骨再生的技术等进行了研究开发(专利文献1～3)。

另外，与培养方法的开发同步，本发明的发明人也开发出了旋转细胞培养装置。例如，在专利文献4～6中提出了一种装置，将在背侧(后侧)配置有气体透过膜的扁平圆筒状的培养容器安装在旋转控制装置的水平旋转轴，以在背面侧悬臂支承的状态使其旋转，由此使培养容器内的细胞团的重力、浮力和从由旋转形成的培养液流受到的力平衡，时间平均时创建出地上重力的百分之一这样的模拟微重力环境，实现细胞团在一定区域中保持悬浮而不会沉降的状态。在这些装置中，在培养容器的正面侧设置观察窗，透过该观察窗，用照相机拍摄细胞团，由此根据细胞的成长和悬浮情况来控制旋转速度，始终维持细胞团在上述一定区域内悬浮的状态。

基于这种情况，本发明的发明人提出了一种有效地大量培养保持未分化性的稳定的iPS细胞的方法(专利文献7)。即，专利文献7所记载的发明通过在模拟微重力环境下培养多能干细胞、特别是iPS细胞，即使在不存在饲养细胞或包被剂的情况下，也能够在保持未分化性的条件下使多能干细胞增殖并形成细胞团，而且，能够在污染风险小的密闭体系中使多能干细胞增殖，因此，还具有能够提高安全性的优点。