[发明专利]检测CTNNBl和HTERT突变的试剂盒和方法及其在HCC检测和疾病管理中的用途

权利要求书

1.用于在含有基因的至少一种第一等位基因的生物样品中表征所述基因的基因组区域中的至少一种第二等位基因的试剂盒，所述试剂盒包含：

第一引物对，其被配置为特异性结合基因组区域侧翼的序列，从而允许在第一PCR反应中扩增含有所述基因组区域的至少一种多核苷酸；和

至少一种钳，每种钳配置为在第一PCR反应中于退火温度下结合所述至少一种第一等位基因中的一种，但不结合所述至少一种第二等位基因中的任何一种，从而选择性地抑制所述至少一种第一等位基因中的一种的扩增，但仍允许所述至少一种第二等位基因的扩增。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其还包括第二引物对和至少一种探针，其被配置为允许在对所述至少一种多核苷酸进行的第二PCR反应中表征所述至少一种第二等位基因中的一种或多种。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其中至少一种所述第一引物对包含在其5’末端的人工序列寡核苷酸，并且被配置为中断所述基因的DNA分子二级结构，或者使用扩增产物作为模板提高第一PCR反应中所述至少一种第一引物对的Tm，从而提高第一PCR反应中所述至少一种多核苷酸的扩增效率。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其中所述基因是CTNNBI，所述基因组区域是编码CTNNBI的密码子32-37的热点区域1，所述至少一种第一等位基因包含热点区域1中CTNNBI的野生型等位基因，所述至少一种第二等位基因包含热点区域1中CTNNBI的一种或多种突变等位基因，并且所述至少一种钳包含特异性靶向CTNNBI的野生型等位基因的桥接核酸(BNA)钳。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其中所述BNA钳具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

6.如权利要求4的试剂盒，其中所述第一引物对分别具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其还包含具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的水解探针，其被配置为允许在对获自第一PCR反应的至少一种多核苷酸进行的第二PCR反应中检测或定量CTNNB1的一种或多种突变等位基因。

8.如权利要求3所述的试剂盒，其中所述基因是hTERT，所述基因组区域包含hTERT起始密码子上游的核苷酸位点-129到-119，所述至少一种第一等位基因包含hTERT的野生型等位基因，所述至少一种第二等位基因包含基因组区域中hTERT的一种或多种突变等位基因，并且所述至少一种钳包含特异性靶向hTERT的野生型等位基因的桥接核酸(BNA)钳。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其还包含DMSO。

10.如权利要求8所述的试剂盒，其中所述BNA钳具有如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。

11.如权利要求8所述的试剂盒，其中所述第一引物对分别具有如SEQ ID NO：11和SEQID NO：12所示的核苷酸序列。

12.如权利要求8所述的试剂盒，其还包含具有如SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列的水解探针，其被配置为分别允许在对获自所述第一PCR反应的所述至少一种多核苷酸进行的第二PCR反应中检测或定量hTERT的野生型等位基因或一种或多种突变等位基因中的任何一种。

13.如权利要求12所述的试剂盒，其还包含分别具有如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列的第二引物对，其被配置用于所述第二PCR反应。