[发明专利]将物质导入植物的方法

说明书

本发明涉及将物质导入植物的方法。本发明的方法包括以下工序：(1‑i)从包含植物的受精卵细胞的组织中分离受精卵细胞，然后，用含有植物组织分解酶的酶溶液对该受精卵细胞进行低效价条件处理；(1‑ii)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的受精卵细胞的组织进行低效价条件处理，接着，将经过酶处理的受精卵细胞分离；(1‑iii)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的受精卵细胞的组织进行低效价条件处理，同时将经过酶处理的受精卵细胞分离；(1‑iv)从植物体中分离卵细胞及精细胞，使它们融合，从而制备受精卵，然后，用含有植物组织分解酶的酶溶液对该受精卵细胞进行低效价条件处理；或者，(1‑v)用含有植物组织分解酶的酶溶液对包含植物的卵细胞的组织进行低效价条件处理，接着，将经过酶处理的卵细胞分离，并进一步使其与分离后的精细胞融合；通过上述(1‑i)～(1‑v)获得经过酶处理的分离受精卵细胞，然后进行下述(2)，(2)将选自核酸、蛋白质及肽的物质导入得到的经过酶处理的分离受精卵细胞。

技术领域

本发明涉及将物质导入植物的方法。

背景技术

对于植物、特别是单子叶植物的基因重组技术而言，以20世纪90年代在稻、玉米中开发了利用土壤杆菌的方法为契机，其应用快速普及，目前为止已开发出了各种转化方法。然而，已知其中多数需要经由植物组织的脱分化和再分化，因此在物种、品种之间转化的效率有很大不同。根据物种、品种的不同，转化效率低，无法得到具有重现性的转化植物。例如，对于在玉米中育种上非常重要的系统B73而言，尚未开发出具有重现性的转化法。

另外，近年来高效地进行基因组编辑逐渐成为可能，但由于根据作物种类、品种的不同，组织培养的容易性不同，这一点对于基因组编辑效率有很大的影响，因此妨碍了植物中的基因组编辑的实用化。

另一方面，在20世纪90年代，尝试了从植物体分离精细胞和卵细胞并使它们人工融合的人工受精，成功地制备了植物体。非专利文献1中记载了使玉米的卵细胞及精细胞进行电融合而制备受精卵细胞，并将其培养为植物体的方法。非专利文献1中在卵细胞的分离中使用了酶的混合物(0.75％果胶酶(pectinase(Serva))、0.25％pectolyase、0.5％半纤维素、0.5％纤维素酶)，但使用的酶、特别是果胶酶(pectinase)的效价高。而且，也没有记载使用利用该卵细胞制成的受精卵细胞进行基因导入、转化的内容。

另外，非专利文献2中记载了稻的雌雄配偶子(卵细胞和中央细胞)的分离方法。具体而言，从植物体分离胚珠后，在0.3M甘露醇溶液中进行了酶处理(用甘露醇溶液(650mosmol/kg·H₂O)+0.3％Pectolyase Y-23、1.5％果胶酶、1％纤维素、1％半纤维素处理10～15分钟)，但与非专利文献1一样，酶、特别是果胶酶的效价高。另外，对象不是受精卵而是受精前卵细胞，对于再生为植物、进行对植物的基因导入、转化的内容也没有记载。

非专利文献3及非专利文献4中记载了通过稻的雌雄配子的电融合而制备受精卵、并将其培养成植物体的方法。这些现有文献中示出了从使雌雄配子人工融合而成的受精卵细胞诱导为植物体的可能性。然而，在上述文献中，与非专利文献2同样地对于基因导入、转化方面完全没有记载，能否使用受精卵进行转化仍然完全不明确。需要说明的是，非专利文献3及4中也没有记载对卵细胞进行酶处理。

对于玉米(非专利文献5、12)、稻(非专利文献6、11)、小麦(非专利文献7)、大麦(非专利文献8、10)、烟草(非专利文献9)等物种而言，已知有从受精后的胚囊采集、培养受精卵、并制备植物体的例子。其中，有如非专利文献5、10那样表明了能够通过显微注射法将DNA导入受精卵细胞的报告，但没有该方法已经实用化的情况的报告。另外，也完全没有利用其它方法进行基因导入的见解。