[发明专利]多项扩增法

说明书

本发明提供一种技术，在使用下一代测序仪主要以多个基因作为目标的情况下，用于有效地均匀地附加测定所必需的人工核酸序列。本发明提供一种方法，该方法使用由包含至少1对以上的包含正向引物(a)和反向引物(b)的引物对的引物对组X、包含正向引物(c)和反向引物(d)的引物对Y、以及包含正向引物(e)和反向引物(f)的引物对Z构成的引物组，同时地扩增多个目标核酸组，所述正向引物(a)在3’末端侧具有与目标核酸互补的序列，在其上游侧具有人工核酸序列A的全部或3’末端侧的一部分序列，所述反向引物(b)在3’末端侧具有与目标核酸互补的序列，在其上游侧具有人工核酸序列B的全部或3’末端侧的一部分序列，所述正向引物(c)在3’末端侧具有人工核酸序列A，在5’末端侧具有人工核酸序列C，所述反向引物(d)在3’末端侧具有人工核酸序列B，在5’末端侧具有人工核酸序列D，所述正向引物(e)具有人工核酸序列C的全部或一部分序列，所述反向引物(f)具有人工核酸序列D的全部或一部分序列。

技术领域

本发明主要涉及进行特定的核酸序列组的检测或序列确定的分析。在特定的实施方式中，本发明提供向作为目标的核酸序列附加包含用于识别样品的作为人工核酸序列的条形码序列(バーコード配列)的1个以上的人工设计的核酸序列(以下称作人工核酸序列)的扩增方法。

背景技术

在医疗中的基因诊断、食品中的卫生检查、环境中的监测等多个领域中，使用检测特定的核酸序列的操作。

而且，近年来由于下一代测序仪兴起，与以往方法的测序法相比核酸序列确定变得相当容易，因此作为新的分析方法显现出流行的趋势。

在下一代测序仪中，为了提供来自于多个样品的扩增产物的混合物，必须在想要进行序列确定的核酸片段的两个末端附加包含用于识别样品的条形码序列的特定的人工核酸序列，在扩增作为目标的核酸序列的步骤以外，还需要用于该目的的核酸扩增反应步骤。

即使使用在对于作为目标的核酸序列而言特异性引物的5’末端侧预先附加有包含条形码序列的特定的人工核酸序列的引物，也可以得到提供给下一代测序仪的核酸片段，然而必须依照核酸序列的种类以样品的个数准备条形码序列不同的引物，极为不经济。为此，希望有将由不同于特异性引物的、仅由人工核酸序列构成的引物用于扩增，在扩增的过程中共同地附加于各个核酸序列的方法。

另外，在作为目标的核酸为多种的情况下，经常使用多重PCR，然而容易在各目标核酸的扩增效率方面产生波动，对于引物设计要求高度的技术。

作为为了抑制扩增效率的波动、并且用于获得附加有人工核酸序列的扩增产物的方法，报告过使用了在3’末端侧具有人工核酸序列的引物、及使用了将该人工核酸序列的全部或3’末端侧的一部分附加于特异性序列的5’末端侧的引物的扩增反应方法(专利文献1、2)。

根据专利文献1、2，通过使具有特异性序列的引物的浓度低于由附加有人工核酸序列的核酸构成的引物(以下称作人工核酸引物)的浓度，共同地附加于全部目标序列的人工核酸引物就可以支配性地进行扩增反应，扩增效率的波动得到抑制。

但是，在使用专利文献1、2的方法制备用于提供给下一代测序仪的核酸序列的情况下，由于以高浓度使用的人工核酸引物为约60～70碱基，形成长链，因此产生引物二聚体的可能性提高。特别是在作为目标的核酸序列为多个的情况下，由于所用的特异性引物的种类增加，因此会高频率地产生引物二聚体。由此，在下一代测序仪分析时会带来目标序列以外的序列信息增多的问题。

此外，一旦作为目标的核酸序列的种类增加，所用的特异性引物的总量就会增加，其结果是，人工核酸引物无法支配性地进行扩增反应，会有没有附加人工核酸序列的核酸序列的比例变高的问题。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2006/023919

专利文献2：日本特表2012－522517

发明内容