[发明专利]超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶

说明书

本文提供了使用具有ssRNA连接酶和ssDNA连接酶活性两者的超热稳定的赖氨酸‑突变型ssDNA/RNA连接酶的组合物、系统和方法。在某些实施方案中，使用此类超热稳定的赖氨酸‑突变型ssDNA/RNA连接酶来将具有5'腺苷酸化端的第一单链核酸序列连接至第二单链核酸序列(例如，在至少75℃的温度下)以形成连接的核酸序列。在其他实施方案中，对所述连接的核酸序列进行测序。

本申请要求2016年3月14日提交的美国临时申请序列号62/307,658的优先权，所述申请以引用的方式整体并入本文。

技术领域

本文提供了使用具有ssRNA连接酶和ssDNA连接酶活性两者的超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶的组合物、系统和方法。在某些实施方案中，使用此类超热稳定的赖氨酸-突变型ssDNA/RNA连接酶来将具有5'腺苷酸化端的第一单链核酸序列连接至第二单链核酸序列(例如，在至少75℃的温度下)以形成连接的核酸序列。在其他实施方案中，对所述连接的核酸序列进行扩增和/或测序。

背景技术

DNA或RNA连接酶是二价金属离子依赖性酶，其利用ATP或NAD+来催化具有3'-羟基和5'-磷酸的相邻多核苷酸末端之间的磷酸二酯键形成(Tomkinson等人,PNAS,2006；Silber等人,PNAS,1972)。取决于它们的物种起源，天然存在的DNA或RNA连接酶可具有许多独特的性质，例如底物特异性、序列和结构域组构、最佳反应条件如pH、辅因子依赖性、温度以及耐盐性等。它们的体外活性也已用于众多分子生物学方案中，从而使它们成为现代生物技术的重要工具。

所有已知的DNA和RNA连接酶经由涉及三个核苷酸基转移反应的共同途径进行催化(Lehman等人,Science,1974；Lindahl等人,Annu Rev Biochem,1992)。在ATP依赖性DNA或RNA连接酶的情况下，第一步骤(步骤1)涉及通过连接酶攻击ATP的α-磷酸，其导致焦磷酸的释放和连接酶-AMP中间体的形成。AMP与保守序列基序内的赖氨酸残基的氨基共价连接。在第二步骤(步骤2)中，将AMP核苷酸转移至5'-磷酸-封端的DNA或RNA链，以形成5’-App-DNA/RNA中间体。在第三且最终步骤(步骤3)中，通过3’-OH链攻击5’-App-DNA/RNA端将两种多核苷酸连接并释放AMP。

DNA连接酶催化双链DNA中的单链切口处形成磷酸二酯键。在体内，这种活性对于在DNA复制、DNA重组和DNA切除修复期间维持基因组完整性至关重要。其中，T4DNA连接酶已在体外广泛用于将双链断裂与粘性末端和平末端连接。RNA连接酶通常分类成至少两个广泛家族。Rnl1家族包括T4 RNA连接酶1(Rnl1)以及来自真菌、酵母和植物的tRNA连接酶。这些酶修复单链RNA中的断裂。Rnl2家族由噬菌体T4 RNA连接酶2(T4Rnl2)以及来自原生动物锥虫属和利什曼原虫属的RNA编辑连接酶代表(Ho和Shuman,PNAS,2002)代表。在体内，这些酶主要密封双链RNA中的切口。在体外，T4Rnl2及其突变体已显示连接单链RNA(Yin S等人,JBC,2003)，以及连接在单链RNA的3'端与单链DNA衔接子的5'-端之间(Viollet等人,2011,BMC Biotechnol)。