[发明专利]发光酶蛋白

说明书

本发明提供一种包含SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的发光酶蛋白及其突变酶。

技术领域

本发明涉及一种发光酶蛋白(发光蛋白、发光酶、荧光素酶)。

背景技术

发光酶(荧光素酶)是在氧化过程期间将发光底物(荧光素)氧化并 由此发光的酶的通用名称。已知四种类型的生物发光相关的发光酶和发光 底物：荧光素-荧光素酶类型(LL-型)、发光蛋白类型、分子间能量转移 型、以及分子内能量转移型(非专利文献1)。

在LL型发光中，发光底物和发光酶发生反应，则该底物用作光发射 体。在发光蛋白型发光中，发光底物固有地存在于发光的脱辅基酶蛋白形 成复合物并被例如由钙离子浓度的增加作为触发剂而激活，由此作为光发 射体。在基于LL型或发光蛋白型的分子间能量转移发光中，所产生的光 激发在发光酶-底物复合物附近的发光蛋白，从而使发光转变到更长的波长 侧。在分子内能量转移发光中，通过发光底物与发光酶反应所产生的能量激发发射体，并由此导致发光，这与固有存在于该发光酶中的底物不同。

LL型是最简单的反应形式，并且因此适合于报告检测系统(reporter assaysystem)、生物成像等。一些商业化的发光产品衍生自萤火虫、海萤 (Cypridina)、叩头虫(Pynearinus termitilluminans)，铁路蠕虫(railroad worm)等，已经可以获得并使用。例如，Promega KK已经出售：使用萤 火虫发光体系的单报告检测系统(专利文献1和2)、使用萤火虫发光体 系和海肾发光体系(Renilla luminescence system)组合的双报告检测系统 (专利文献3)、使用Oplophorus gracilirostris发光体系的低分子量发光 酶的高度发光报告检测系统(专利文献4和非专利文献2)等。使用海萤 分泌发光体系的高通量报告检测系统已经由ATTO售出(非专利文献3和 专利文献5)。使用分泌发光体系桡足类Gaussia和海萤的荧光素酶检测 系统已经由New England Biolab公司出售(非专利文献4)。使用通过修 饰西表岛萤火虫(Iriomote firefly)(日本铁路蠕虫)发光体系和铁路蠕虫 发光体系而得到的单发光酶的同步三色报告检测系统(非专利文献5、专 利文献6和7)以及使用Pynearinus termitilluminans发光体系的高安全性 和高强度报告检测系统(非专利文献6)已经由Toyobo Co.，Ltd出售。

所有这些产品都使用LL型反应生物发光。间鞘翅目、萤火虫荧光素 已被用作常用的发光底物；在海萤中，海萤荧光素已被用作发光底物；以 及同时在Gaussia和海肾二者中，腔肠素已被用作发光底物。海萤荧光素 和腔肠素是不同的分子；然而，它们都具有一个作为主骨架的咪唑吡嗪酮 结构(非专利文献7和8)。新近生产用作发光底物的Furimazine被用作 来自Promega KK的Oplophorus gracilirostris衍生的发光酶的发光底物， 它也是具有咪唑吡嗪酮结构的分子。

多报告检测系统通过组合多个具有不同波长的发光体系来执行。然而， 目前，对萤火虫荧光素系统，可使用萤火虫荧光素系统的波长范围为530 至630nm，对海萤荧光素和腔肠素系统则为460至490nm。一般而言，许 多远洋发光生物具有450至490的最大发光波长，许多陆生生物具有550 至580的最大发光波长。相反，虽然不常见，但可以在沿海发光生物中发 现500nm附近的发光(非专利文献9)。然而，还没有出现过对500nm附 近的发光体系进行基因克隆的例子，因此该发光体系还没有实际用在报告 检测系统等中。特别地，510nm的波长，处在目前为止已经使用的490nm 和530nm的中间，在其他发光体系的组合使用中是高度可用的。

引文列表

专利文献

专利文献1：美国专利第5641641号

专利文献2：美国专利第5650289号

专利文献3：美国专利第7078181号