[发明专利]用于分开单克隆抗体的同种型的方法

说明书

重组表达的抗体群的电荷变体可与主要抗体分子分开，也可彼此分开。电荷变体的分开和分离可通过在从阳离子交换载体洗脱电荷变体的过程中组合调节盐浓度和pH来进行。分离的电荷变体可用于评估其对总抗体制备物的效力的贡献。因此，可至少在电荷变体的比例和主要抗体的比例方面控制抗体制备物的组成，例如用于生物相似匹配或用于改善制备物的效力。

关联申请

本申请要求在2016年1月8日提交的美国专利申请号 62/276378的优先权，将其内容以引用的方式整体并入本文中。

技术领域

本发明主要涉及蛋白生物化学和分析化学领域。更具体而言，本发明涉及用于分级分离单克隆抗体的电荷变体的分析色谱方法，其提供富集的或更均质的抗体制备物，也提供降低抗体制备物效力的电荷变体的除去。

以引用的方式并入的序列表

将创建于2017年1月4日且大小为6KB的命名为“ONBI-007001WO_SeqList.txt”的文本文件的内容以引用的方式整体并入本文中。

背景技术

在本说明书各处引用了包括专利、公开的申请、登录号、技术论文和学术论文在内的各种出版物。这些所引用的出版物各自以引用的方式整体并入本文中用于所有目的。

单克隆抗体(mAb)可用作治疗蛋白。纯化的单克隆抗体通常多出现在复杂的异质混合物中。单克隆抗体具有电荷异质性，其优化得到有利的静电相互作用的平衡，并且决定它们的结构、稳定性、结合亲和力、化学性质，并因此决定它们的生物活性。存在由酶促过程或自发的降解和修饰引起的在蛋白表达和生产过程中产生的异质性形式。

抗体通过几种不同的机制经历化学修饰，所述机制包括氧化、脱酰胺、糖化、异构化和片段化，导致形成各种电荷变体和异质性。化学修饰和酶修饰(例如脱酰胺和唾液酸化)导致mAb的净负电荷增加，并引起pI值降低，由此导致形成酸性变体。C端赖氨酸切割导致净正电荷的丧失，并导致形成主要抗体或酸性变体。另一种产生酸性变体的机制是形成各种类型的共价加合物，例如糖化，其中如果制剂中存在还原糖，则葡萄糖或乳糖可在富含葡萄糖的培养基中生产过程中或储存过程中与赖氨酸或精氨酸残基的伯胺反应。碱性变体的形成可产生自一个或多个C端赖氨酸的存在或脯氨酸酰胺化、琥珀酰亚胺的形成、氨基酸氧化或唾液酸的除去，这引入额外的正电荷或除去负电荷，两种类型的修饰均引起pI值的增加。

由于可能对效力产生影响，应对翻译后修饰(PTM) (例如天冬酰胺的脱酰胺、天冬氨酸的异构化和蛋氨酸氧化)进行评估。但是，考虑到生物治疗剂(例如mAb)的复杂性，完整分子的PTM和效力分析通常提供有限的信息。因此，特别是就结构-功能关系而言，仍然需要针对其对制备物的大体上的影响来挑选和评估变体分子。

发明内容

本公开的特征在于用于分开重组表达的抗体的同种型的方法。分开可允许例如评估抗体结构与功能之间的关系。这样的同种型包括酸性电荷变体、碱性电荷变体和主要抗体。这些同种型属于单克隆抗体。

大体上，本文提供用于分开重组表达的抗体的同种型的方法，包括：将包含抗体和所述抗体的多种电荷变体的重组表达的抗体制备物加载到含有能够捕获所述抗体和电荷变体的配体的阳离子交换色谱载体上；和如下分级分离所述电荷变体：使含有约20mM~约30mM的MES且具有约6.1的pH的第一流动相缓冲液通过载体，在第一流动相缓冲液通过载体的同时，向第一流动相缓冲液中加入含有约40mM的磷酸钠~约60mM的磷酸钠和约95mM的氯化钠且具有约8.0的pH的第二流动相缓冲液，以得到约90体积%的第一流动相缓冲液和约10体积%的第二流动相缓冲液的混合物，通过逐渐增加所述混合物中第二流动相缓冲液的量以得到约55体积%的第一流动相缓冲液和约45体积%的第二流动相缓冲液，从配体梯度洗脱一种或多种电荷变体，并收集一种或多种电荷变体至分开的级分中。