[发明专利]通过去脂作用灭活病毒

说明书

本发明涉及含有包膜病毒的疫苗，所述病毒的包膜中已经使用甲基‑β‑环糊精(MBCD)将脂质消耗。以两步方法去脂包膜病毒消除了这些病毒的感染性，这使去脂病毒安全地用在疫苗中。与其他方法相反，使用MBCD消耗脂质如胆固醇导致病毒含有低于20％的未处理病毒胆固醇，但这种去脂病毒保留了至少85％的未处理病毒蛋白质含量。MBCD去脂也保留了病毒蛋白的免疫原性。本发明在两步方法中使用MBCD处理来去脂包膜病毒代表了用于产生掺入有效疫苗中的灭活病毒的新替代选择。

本发明涉及含有包膜病毒颗粒的疫苗，其包膜已用甲基β-环糊精(MBCD)去脂。

病毒是一种本身没有代谢活性的移动的遗传元件。相反地，病毒必须感染宿主细胞并使用该宿主细胞的能量和过程以便繁殖。一些病毒是“裸露的”，这意味着单个病毒颗粒或病毒粒子仅由病毒基因组周围的衣壳组成，并且可能还有一些病毒编码的非结构蛋白。在其他病毒中，衣壳包含在膜或包膜内。由于病毒基因组通常太小而不能编码参与脂质合成的蛋白质，所以这种包膜病毒必须从宿主细胞脂质构建它们的包膜。病毒包膜的脂质含量因此取决于宿主细胞的脂质特征而变化。

病毒很适合其宿主生物体，并且经常是致病的，导致宿主疾病甚至死亡。病毒可以通过感染人类和/或其伴侣动物或通过影响作为食物来源的植物和动物而产生巨大的经济影响。疫苗是保护宿主动物免受病毒感染的优选方法。疫苗对病毒产生保护性免疫应答，包括产生抗体和细胞免疫。通常需要两种类型的反应来减少宿主细胞的新感染并从宿主中清除病毒颗粒和感染的细胞。

近40年前，Moore等人(J.Virol.27(2)：320-329,1978)显示使用从病毒包膜中消除胆固醇的不含胆固醇的囊泡会降低病毒颗粒感染其靶细胞的能力。相反地，其他研究人员报道了病毒感染性需要胆固醇存在于靶细胞膜中，而不是在病毒包膜中。还有其他人认为去除胆固醇的过程而不是在包膜中缺乏胆固醇是感染性下降的原因。无论胆固醇在病毒功能中的作用如何，完全和永久的感染性丧失在消耗胆固醇的病毒中都没有得到证实，也没有证明消耗胆固醇的病毒可用于安全有效的疫苗。

已经报道了消耗胆固醇的化学手段，诸如，例如使用环糊精，正丁醇，二异丙醚(DIPE)，氟醚如七氟醚(sevoflurane)，表面活性剂如TRITON X-100^TM(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚或聚氧乙烯辛基苯基醚)或TWEEN 20^TM(PEG(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯)，二乙醚及其组合。一些化学手段已被证明过于苛刻，导致病毒蛋白从病毒粒子中丧失，或导致结构变化为其余蛋白质。为了使消耗胆固醇的病毒粒子用于疫苗，特别是刺激针对病毒包膜蛋白的中和抗体产生的疫苗，蛋白质的存在和天然构象将是必需的。

在一些情况下，胆固醇的去除已被显示是可逆的。添加外源胆固醇可以重建病毒包膜并恢复感染力。这可能会引起关于在疫苗中使用消耗胆固醇的病毒的安全性担忧，因为存在于血液或其他体液或甚至宿主细胞膜中的胆固醇和其他脂质，与消耗胆固醇的病毒粒子接触可能潜在地重建病毒粒子并恢复感染力。

含有减毒病毒的疫苗通常在产生保护性免疫方面被认为是最有效的。然而，存在着减毒病毒可能会突变或重组，从而回复到致命状态的安全担忧。灭活的(即杀死的)病毒通常被认为在疫苗中应用更安全，但灭活手段经常改变或破坏抗原表位，因此作为保护性免疫的刺激物的有效性降低或丧失。

由于缺乏有效的疫苗，包膜病毒继续对人类和非人类动物构成健康风险，由包膜病毒引起的疾病具有巨大的经济影响。需要既安全又有效的改进的疫苗。例如，保留病毒抗原免疫原性、维持病毒粒子完整、并且赋予很少或没有安全风险的灭活包膜病毒的改进方法将有益于减轻由包膜病毒引起的疾病。本申请公开了这种改进的病毒灭活方法，包括用MBCD去除病毒包膜的脂质。