[发明专利]用于高保真测序的方法和系统

说明书

本文描述了用于高保真测序和鉴定样品中稀浓度的罕见突变的系统和方法。在多个方面，使用包括衔接子连接条件和杂合体捕获富集组的专门的文库制备技术与对照一起使用，以增加序列即用分子的产率并鉴定污染和错误且使污染和错误最小化。系统和方法还涉及使用系综和拟极大似然模型分析测序数据以区分真实变体和假阳性。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年1月22日提交的美国临时专利申请序列号62/286,110的优先权权益，该申请的公开内容通过引用以其整体并入本文。

发明领域

本发明涉及通过测定优化和数据分析用于样品中的稀变体(dilute variants)的高保真测序和鉴定的系统和方法。

背景

仅在美国每年诊断出数百万例癌症，并有数十万人死亡。包括癌症在内的许多疾病的根源是个体DNA中的遗传突变或变体。在癌症的情况下，这些突变可导致异常的细胞生长，这可能是无法控制的并导致死亡。这些疾病和潜在的突变的早期检测可能对成功治疗这些疾病至关重要。最近的进展允许从血液和其他体液分离肿瘤来源的核酸和其他无细胞核酸。这些发展允许患者突变的更便宜、非侵入性的检查和表征。不幸的是，感兴趣的突变，特别是在疾病发展的早期阶段，通常以低于标准测序错误率的频率发生。大多数无细胞核酸包括个体的正常基因组序列，而少得多的量为肿瘤起源的，呈现肿瘤特异性突变。现代测序和分析技术以在每1,000个位置读段中1个错误或99.9％的错误率进行，并且通常不足以在无细胞样品诸如血液或血浆中检测罕见肿瘤变体。问题在于，在测序过程中区分实际突变和通过错误引入的假阳性变得几乎不可能。因此，以低频率出现的疾病特异性突变的早期鉴定的诺言未被实现，并且丧失了早期干预的益处。

概述

本发明涉及用于罕见核酸变体的高保真测序和鉴定的方法和系统。本发明的系统和方法可用于鉴定无细胞核酸样品中的罕见变体，例如包含正常基因组核酸多数的样品中的肿瘤特异性突变。本发明的系统和方法允许样品中以低于1:10,000的频率发生的突变的可靠鉴定。这种罕见变体的鉴定来自测序过程中几个步骤的优化，然后是基于本文称为系综(ensembles)的对齐读段对的测序读段的分析。

本发明的系统和方法可以在罕见变体鉴定之外应用，诸如性能或灵敏度的期望水平的测序优化。通过使用本发明来对特定的应用定制测序程序，从业人员可以通过仅要求特定应用必需的确切数量的测序读段来避免另外的成本和时间。

本发明的各方面包括用于核酸测序的方法。方法的步骤可包括：获得核酸的测序读段，鉴定包含具有共享起始坐标和读段长度的两个或更多个测序读段的系综，确定系综所包括的测序分子的数量，鉴定系综中的候选变体，并且使用似然估计模型和所确定的测序分子的数量来确定候选变体是真实变体的可能性。在某些实施方案中，获得测序读段的步骤可进一步包括从核酸制备测序文库，扩增测试文库，并使用下一代测序(NGS)将测序文库测序。在某些实施方案中，衔接子可以在被配置为允许衔接子堆叠的条件下连接至核酸。测序文库的制备可包括使用约16小时的反应时间、在约16摄氏度的温度将衔接子连接至核酸。扩增步骤可以包括PCR扩增，并且本发明的方法可以进一步包括使用计算机模型选择所需的过度扩增因子和PCR循环数目以检测在样品中的指定浓度的变体。

在各种实施方案中，本发明的方法包括基于包括鸟嘌呤-胞嘧啶(GC)含量、靶群体中的突变频率和序列独特性的因素设计靶向基因组区域的杂合体捕获组，并在测序步骤之前使用杂合体捕获组捕获扩增的核酸。捕获步骤可以包括使用靶向靶基因座的有义链的第一杂合体捕获组和靶向靶基因座的反义链的第二杂合体捕获组。