[发明专利]用于筛选核酸适配体的方法

说明书

本发明涉及用于筛选核酸适配体的方法，其包括下述工序：(a)使固定于固相载体上的靶分子与核酸适配体候选物接触，(b)通过毛细管电泳来分选已与靶分子结合的核酸适配体候选物，(c)通过PCR对核酸适配体候选物进行扩增。

技术领域

本发明涉及用于筛选核酸适配体的方法。

背景技术

所谓核酸适配体，是指具有分子识别能力的单链DNA或RNA，于1990年由Ellington等人和Tuerk等人首次报道。核酸适配体可通过被称为指数富集配体系统进化(SystematicEvolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX)的进化工程学方法获得，也已报道了大量的具有能与抗体相匹敌的结合能力、特异性的核酸适配体。此外，能够针对以蛋白质、细胞为代表的难以取得抗体的低分子化合物这样的各种靶标而取得适配体，在治疗药、诊断药中的应用受到期待。然而，抗体的获得概率据称为90％以上，与此相对，目前的核酸适配体的获得概率据称为30％以下。即，可以说核酸适配体的获得概率的技术性提高是今后要将核酸适配体在产业上广泛应用时所面临的主要课题。

核酸适配体作为代替抗体的新型的分子识别成分而受到关注，但一般认为核酸适配体的获得率为30％以下，期望开发出高效的适配体获得方法。CE-SELEX是利用了毛细管电泳的优异的分离能力的快速筛选核酸适配体的方法。然而，由于实验条件设定(分选区域的设定)的难度、作为靶标的分子必须为在与ssDNA文库结合时电泳迁移率大幅变化这样的一定程度以上的大小的限制，不能否认其缺乏通用性。

CE-SELEX中，分选区域的设定是影响适配体获得率的重要的要素。需要将未混入不具有对靶标的结合能力的ssDNA文库的、确实地包含与靶标形成了复合体的ssDNA文库的区域分选出来。理想的分选区域是来自ssDNA文库与靶标的复合体的峰的范围。然而，靶分子为MutS蛋白那样容易与ssDNA发生相互作用的分子，并且，只要不使用高灵敏度的荧光检测器，就难以检测出ssDNA文库与靶标的复合体。此前，为了优化分选区域，已尝试了多种方法：通过荧光修饰而使靶蛋白质可视化，通过实时PCR来预测靶标-适配体复合体的检测位置，等等。然而，仍然难以检测出复合体，通常是将从靶分子的检出位置开始至即将检出ssDNA文库之前为止的区域作为分选区域。该分选区域的设定方法中，存在下述这样的问题：在中途解离的结合能力低的序列也容易被包含在分选区域中(图1A)。

另外，在将低分子化合物等小分子作为靶标时，几乎不能期待与ssDNA文库结合时的电泳迁移率变化，因此，认为难以应用CE-SELEX。通过CE-SELEX获得针对低分子化合物的适配体的例子迄今只有一例，由此也可窥见其难度(非专利文献1)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Yang,J.Bowser,M.T.Capillary Electrophoresis-SELEXSelection of Catalytic DNA Aptamers for a Small-Molecule PorphyrinTarget.Anal.Chem.85,1525-1530(2013).

发明内容

发明所要解决的课题

本发明提供在有效发挥CE-SELEX的优点的同时、解决了实验条件设定的难度、可应用的靶分子种类少这样的缺陷的新型CE-SELEX。具体而言，本发明涉及组合了粒子和CE-SELEX的用于筛选核酸适配体的方法。此前虽然报道了组合了粒子和毛细管电泳的RNA、抗原的定量分析方法，但尚未报道组合了粒子和CE-SELEX的方法。

用于解决课题的手段

本申请的发明人进行了深入研究，结果发现，通过将粒子与CE-SELEX组合能解决以往的课题，从而完成了本发明。

本发明涉及以下方案。