[发明专利]用于定量显微镜下可视的颗粒样品纯度的方法

说明书

所述方法用于将显微镜下可视的样品的纯度量化。将待分析的样品置于电子显微镜中，以获得所述样品的电子显微镜图像(100)。所述样品包含物体(114)。增强具有与初级颗粒(120)的大小范围不同的大小和在所述初级颗粒(120)的大小范围内的大小的所述物体(114)。将所述物体(114)检测为初级颗粒(120)或碎片(106)。从所述物体(114)中排除检测到的所述初级颗粒(120)，使得所述物体(114)包含碎片(106)，但不包含初级颗粒(120)。测量检测到的所述碎片(106)的第一总面积(T1)。测量检测到的所述初级颗粒(120)的第二总面积(T2)。

技术领域

本发明涉及使用电子显微镜评估和定量测量样品纯度的方法。

背景技术

开发和生产生物药物通常涉及若干纯化步骤，在这些步骤中，应该去除细胞碎片、破碎颗粒、其他污染物和团簇等，使得最终产品只包含所期望的初级颗粒。所感兴趣的初级颗粒(即，非聚集初级颗粒)在最终产品中的纯度和分散性对于其质量和功效而言是重要的。因此，定量评估纯度对于最终产品而言是重要的，而且在上游开发和生产过程中也是如此，以评估每个纯化步骤的功效和效果。电子显微镜是一种方法，通过该方法可以以足以识别样品中的所感兴趣颗粒(初级颗粒)以及不期望碎片、污染物和团簇的分辨率对显微镜下可视的颗粒进行成像。在许多过程中，客观地定量测量液体样品中的显微镜下可视的颗粒(诸如，病毒颗粒、病毒样颗粒、无机珠和其他纳米颗粒和微粒)的纯度是重要的。例如，修饰的病毒载体通常用于基因治疗应用，修饰的病毒颗粒用作疫苗。然而，目前可用的定量评估纯度的方法不是很准确，而且常常涉及可能扭曲最终结果的手动步骤。需要用更有效和可靠的方法来评估和测量含有显微镜下可视的初级颗粒和污染物/碎片的液体样品的纯度。

发明内容

本发明的方法提供了对上述问题的解决方案。更具体地，该方法用于将在显微镜下才能看到的颗粒样品的纯度量化。将待分析的样品置于电子显微镜中，以获得样品的电子显微镜图像。样品包含初级颗粒物以及碎片。碎片可能是破碎的或者是初级颗粒的部分(子单元)和/或污染物和/或初级颗粒或碎片的团簇或聚集物和/或来自生产阶段的剩余材料。图像中的物体被增强，并且具有与初级颗粒的大小范围不同的大小和在初级颗粒的大小范围内的大小。图像中的物体被检测为初级颗粒或碎片。从剩余物体中排除检测到的初级颗粒，使得被检测为碎片的物体只包含碎片，不含初级颗粒。测量检测到的碎片的第一总面积(T1)。测量检测到的初级颗粒的第二总面积(T2)。计算第一总面积(T1)与第二总面积(T2)的比率，以确定样品纯度的定量测量值。

在另一个实施例中，增强图像中的物体边缘，并且物体的大小与初级颗粒的大小范围大体相近。对物体的圆度进行分析，以识别初级颗粒。

在另一个实施例中，将具有与初级颗粒基本类似的形状的图像中的物体识别为初级颗粒。

在另一个实施例中，增强图像中的物体边缘，并且物体的大小与初级颗粒的大小范围大体相近，并且分析物体的径向密度分布，以识别初级颗粒。

在又一个实施例中，增强图像中的物体边缘，并且物体的大小与初级颗粒的大小范围大体相近，并且通过测量物体内部的平均强度与恰在物体外部的平均强度相比较来分析物体边界处的信噪比。

在又一个实施例中，增强图像中的物体边缘，并且物体的大小与初级颗粒的大小范围大体相近，并且通过分析物体外边缘的清晰度来测量物体的局部对比度。

在又一个实施例中，增强图像中的物体边缘，并且物体的大小与初级颗粒的大小范围大体相近，并且利用纹理分析来测量物体的结构，以识别初级颗粒。

在另一个实施例中，利用纹理分析来测量图像中的物体的结构，并且分析该结构，以识别初级颗粒。

在另一个实施例中，将含有病毒颗粒或病毒样颗粒的样品置于电子显微镜中。