[发明专利]一种熊去氧胆酸的制备方法及其制备用酶2有效
| 申请号： | 201780001726.9 | 申请日： | 2017-01-09 |
| 公开（公告）号： | CN107980064B | 公开（公告）日： | 2021-07-06 |
| 发明（设计）人： | 刘立辉;傅荣昭;刘滔滔;曹磊;彭亭 | 申请（专利权）人： | 深圳市邦泰绿色生物合成研究院 |
| 主分类号： | C12P33/02 | 分类号： | C12P33/02;C12N9/04 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 518102 广东省深圳市宝安区西乡街道桃*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 熊去氧 胆酸 制备 方法 及其 | ||
1.一种熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于：以3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸为底物，在NADP、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶以及缓冲溶液存在的条件下，用7β-类固醇脱氢酶催化3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸制备熊去氧胆酸，所述7β-类固醇脱氢酶来源于肠球菌Enterococcussilesiacus，所述葡萄糖脱氢酶来源于巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium，其基因序列如SEQ ID NO：3所示，在整个催化反应体系中，所述底物的浓度为50～100mg/mL，所述NADP的浓度为0.01～0.25mg/mL，所述葡萄糖的浓度为30～50mg/mL；所述缓冲溶液为50～100mM磷酸钾缓冲液；控制所述催化过程在温度为25～35℃，pH值为7.5～8.5的条件下进行；所述7β-类固醇脱氢酶为如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质，
(b)在(a)限定的氨基酸序列的基础上经过取代至少一个氨基酸所获得的下述任意一个突变体的蛋白质：D66N+L67K、Y90W+V91A、A150I+I153K以及D200N。
2.根据权利要求1所述的熊去氧胆酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括如下提纯步骤：待所述催化过程反应结束后，调节pH值为10.5～12.5，除去不溶物，再调节pH值为1.0～2.0，水浴50-60℃，搅拌20～30min，待冷却后过滤、经水洗三次后真空干燥即得熊去氧胆酸的成品。
3.一种7β-类固醇脱氢酶，其特征在于：所述7β-类固醇脱氢酶来源于肠球菌Enterococcus silesiacus，用于催化3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸制备熊去氧胆酸，所述7β-类固醇脱氢酶为如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质，
(b)在(a)限定的氨基酸序列的基础上经过取代至少一个氨基酸所获得的下述任意一个突变体的蛋白质：D66N+L67K、Y90W+V91A、A150I+I153K以及D200N。
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