[发明专利]一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的制备方法及其制备用酶1

说明书

本发明涉及一种利用生物酶催化技术制备3α‑羟基‑7氧代‑5β‑胆烷酸的方法及其制备用7α‑类固醇脱氢酶。该方法以鹅去氧胆酸为底物，在NAD、乳酸脱氢酶、丙酮酸钠以及缓冲溶液存在的条件下，用7α‑类固醇脱氢酶催化鹅去氧胆酸制备3α‑羟基‑7氧代‑5β胆烷酸，其中7α‑类固醇脱氢酶来源于盐单胞菌Halomonas jeotgali sp.。该方法操作简单、反应条件温和易控、反应时间短、对底物的转化率高达99.7%以上，所获得的产品的含量在97.5%以上。

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物技术领域，特别涉及一种利用生物酶催化技术制备3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的方法及其制备用7α-类固醇脱氢酶。

背景技术

3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸又名7-酮石胆酸，是制备熊去氧胆酸的重要中间体。而熊去氧胆酸是名贵中药熊胆的主要有效成分，具有增加胆汁酸分泌、并使胆汁成分改变、降低胆汁中胆固醇及胆固醇脂等功效，主要用于治疗胆石疾病。众所周知，熊胆是一种非常稀缺的资源，原因在于其获取的传统途径主要是依赖于人工养殖活熊取胆的方法。目前，这种周期长、收率低且不人道的传统途径逐渐被人工合成方法所取代，而现知的人工合成熊去氧胆酸的方法中，3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸都是极为重要的中间体。

目前3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的工业化生产多采用化学法，但是存在操作条件苛刻、选择性低、污染环境、使用大量有机溶剂、存在有机溶剂残留、有毒有害等缺点。为了解决化学法存在的诸多缺点，人们另辟蹊径，寻找更好的生产途径。中国发明专利CN1912192B公开了一种采用电化学合成制备3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的方法，但是此种方法依然需要使用有机溶剂，并且成本较高。中国发明专利申请CN105368828A公开了一种采用全细胞催化制备3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的方法，但是此种方法需进行细胞发酵培养，存在反应时间长、操作繁琐、产物复杂等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的新的制备方法，以解决上述背景技术中提到的现有制备方法所存在的有机溶剂残留、条件苛刻、反应时间长、操作繁琐、成本较高、污染环境等缺点，本发明同时提供了该新制备方法适用的生物酶。

为实现上述目的，发明人经过长期大量的实验摸索，在经历上百次的失败尝试之后，终于筛选出适用于细胞外生物催化制备3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的生物酶，并在此序列基础上进行优化，获得了活性提高和去除底物抑制的突变体酶，从而开发出一种新的制备3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸的方法，其特征在于：以鹅去氧胆酸为底物，在NAD、乳酸脱氢酶、丙酮酸钠以及缓冲溶液存在的条件下，用7α-类固醇脱氢酶催化鹅去氧胆酸制备3α-羟基-7氧代-5β胆烷酸，所述7α-类固醇脱氢酶来源于盐单胞菌Halomonas jeotgali sp.，所述乳酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，在整个催化反应体系中，所述底物的浓度为50～100mg/mL，所述NAD的浓度为0.01～0.25mg/mL，所述丙酮酸钠的浓度为10～30mg/mL。

上述方法中所使用的两种酶的具体存在形式包括液态酶、固态酶以及各种固定化酶，可以是未经纯化的粗酶形式，也可以是经部分纯化或完全纯化的形式。

优选地，控制所述催化过程在温度为25～35℃，pH值为7.5～8.5的条件下进行。

优选地，所述缓冲溶液为50～100mM磷酸钾缓冲液。

优选地，上述制备方法还包括如下提纯步骤：待所述催化过程反应结束后，调节pH值为1.0～2.0，搅拌20～30min，待冷却后再经过滤水洗干燥后即得3α-羟基-7氧代-5β-胆烷酸成品。