[实用新型]一种大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置

说明书

本实用新型公开了一种大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置，其包括荧光激发光路和荧光检测光路；沿荧光激发光路，光源装置发射的激发光依次经聚焦装置和物镜装置入射至置于载物台的数字PCR芯片上；沿荧光检测光路，数字PCR芯片受激发光产生的荧光依次经物镜装置、聚焦装置和成像装置成像后传输至图像采集传感器；其中，载物台还设有温控装置，温控装置实时控制数字PCR芯片反应的循环温度。本实用新型可以实现高通量、高灵敏度、高特异性的实时数字qPCR检测，对于提高数字PCR检测仪器性能、精度和通量具有重要意义。

技术领域

本实用新型涉及生物医学检验领域核酸检测领域，特别涉及一种能够实现大面积数字PCR微滴荧光高通量检测装置。

背景技术

在肿瘤早期诊断筛查、血液病毒分型及载量分析、无创产前诊断等领域，都需要对超低浓度的核酸进行高速高灵敏度高特异性的检测，常规的PCR已越来越无法满足需求。为实现此功能，人们在PCR基础上，发展了一种数字PCR技术，将检测灵敏度提高了1～2个数量级。

微滴式数字PCR采用的“分而治之”(divide and conquer)的检测策略，将样品、PCR试剂混合物作为分散相，将油作为连续相，利用微流控技术，将样品混合物形成一个个液滴悬浮于连续相中。进而，将一个标准PCR扩增分配至大量微滴(纳升至皮升)中，每个微滴中仅包含0个或1个拷贝的目标分子(DNA模板)。对每个微滴进行独立PCR扩增，扩增结束后，检测每个微滴的荧光，对阳性信号的微滴进行计数，从而得到样品模板的绝对拷贝数和核酸浓度。微滴的尺寸和数量决定了数字PCR的检测灵敏度和下限，现有的数字PCR微滴数在2万～1000万之间。

现有的商用微滴式数字PCR技术操作如下：在专用的微滴制备芯片上制备液滴；通过移液器将微滴转移至离心管中，使用常规的PCR仪进行温度循环扩增；扩增完成后，利用流式技术依次对每个微滴进行荧光激发与探测，计算结果。这样的检测方式存在以下问题：

(1)流式检测速度较慢，检测速度在200～500个/s，检测过程耗时久，通量低；

(2)只能对单个微滴进行终点法检测,不能实时qPCR，降低了特异性和灵敏度；

(3)光路硬件复杂，难以实现多重数字PCR检测(4重以上)；

(4)两次液滴的转移过程将导致微滴损失，以及可能引来的外界污染；

(5)常规PCR扩增仪的加热块热惯量大，热循环时间长(2小时左右)。

为解决上述五个问题，申请人已提出了一体式数字PCR芯片，并已申请实用新型专利(申请号201510961967.0)。参见附图1，一体式数字PCR芯片包括本体1，位于其上的连续相注入孔11、样品注入孔12、单层微滴平铺腔体15、真空接入孔16、用于生成微滴的“+字型”微结构13，以及用于连接连续相注入孔11和“+字型”微结构13的液路14、用于连接样品注入孔12和“+字型”微结构13的第一液路17、用于连接“+字型”微结构13和单层微滴平铺腔体15的第二液路18。通过MEMS工艺将所述所有微结构制作于一片聚合物基板上，随后与另一块聚合物平板相键合而形成封闭的微流道系统，在连续相注入孔11、样品注入孔12、真空接入孔16三处开孔，用于注入样品和施加负压。

参照图2，其基本原理为：在连续相注入孔11注入油、样品注入孔12注入样品后，在真空接入孔16施加真空负压，样品、连续相将在负压的作用下，通过流道14和17到达“+字型”微结构13。在此处，样品将因连续相的剪切而形成一个个纳升级微滴20，随后经过流道18进入单层微滴平铺腔体15，平铺成微滴单层19。