[实用新型]新型多角度环状光学照明显微成像系统

说明书

技术领域

本实用新型属于新型显微镜技术领域，尤其涉及一种新型多角度环状光学照明显微成像系统。

背景技术

全内反射荧光显微镜(total internal reflection fluorescence microscopy,TIRFM)是近年来新兴的一种光学成像技术，该技术利用全内反射时在介质另一面产生的强度成指数衰减的倏逝波来激发位于倏逝场内的荧光分子，以观察用荧光标记且靠近交界面极薄区域的样品，观测的动态范围通常在200nm以下，有效地控制了激发体积，大大降低了背景光噪声干扰，能帮助研究者获得高质量的成像质量和可靠的观测数据。故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。

环状TIRF利用一个环状光圈形成TIRF照明成像，它的优势在于减少了单点入射照明引起的干涉条纹，快速的多角度成像减少了3D成像以及单角度成像产生的色差，并提供了进行图像3D断层重建的可能。

EPI指的是垂直式荧光显微镜。激发光以近乎垂直交界面的形式入射，使得进入样本区域的荧光强度仍旧非常强，可激发样本上标记出的全部荧光染料。

HILO(Highly inclined laminated optical)是在入射角将要进入TIRF 时产生的，成像时噪声比例非常小，信噪比可以达到EPI的数倍，非常适合观察活细胞的活动，但是与TIRF相比很难测定成像的深度，无法进行定量分析。

目前市场上的商业全内反射荧光显微镜并不具备能自由切换入射角度和 TIRF环状照明及快速改变环大小的功能，也无法实现便捷的荧光成像模式转换。在多色成像实验研究中，没有考虑到不同波长的入射光在相同的入射角下产生的倏逝场的渗透深度不同，从而导致不同波长入射光下采集到的图像包含不同深度的目标这一问题，极大地干扰到后期的分析处理。另外，由于系统缺少具有4f的光学系统，无法保证近似完美的环状TIRF照明，从而影响到系统的成像质量。

发明内容

本实用新型提的目的是针对现有技术不足，提供一种新型多角度环状光学照明显微成像系统。

本实用新型解决其技术问题所采用的技术方案如下：

本实用新型包括激光器、单模光纤、准直透镜、四分之一波片、4f二维扫描振镜系统、聚焦镜、二色镜、TIRF显微物镜、样品台、滤波片、第二场镜、探测器；

单模光纤、准直透镜、四分之一波片、4f二维扫描振镜系统依次位于激光器出射光束的光轴之上，所述扫描振镜系统包含两个一维振镜和两个透镜，两个透镜组成4f系统，两个一维振镜的反射面分为位于4f系统的共轭面上；聚焦镜、二色镜依次位于经4f二维扫描振镜系统射出光束的光轴上； TIRF显微物镜、样品台依次位于二色镜反射光束光轴上，滤波片、第二场镜、探测器依次位于二色镜透射光束光轴上；所述样品台位于TIRF显微物镜的焦平面处，所述探测器的采集孔位于第二场镜的焦平面处。

激光器发射的准直激光光束，首先被导入单模光纤，从单模光纤射出的激光光束，经过准直透镜完成准直；经过准直后的光束通过四分之一波片来调节，使其形成圆偏振光，之后入射到二维振镜系统中，通过二维振镜系统来控制入射光的偏转角从而达到控制入射激光的入射角的目的，为了消除伪影现象，这个二维振镜系统被安装在4f系统的共轭面上，从而确保了入射光斑是一个完美的圆形，在多色成像的实验研究中，可以通过控制二维振镜上的电压值，使得在不同波长入射光下的TIRF场的渗透深度保持一致；二维振镜系统的出射光，平行射出分别经聚焦镜和二色镜的聚焦和反射后，聚焦于TIRF显微物镜并投射于样品台上的待测样品之上；待测样品所发射的信号光被TIRF显微物镜收集，先通过二色镜透射后再依次经过滤波片滤去杂散光，其次经第二场镜聚焦，最终被探测器采集，探测器记录此时探测到的光强信号。

所述的4f二维扫描振镜系统由两面一维振镜和组成4f系统的两个等焦距透镜组成，两个一维振镜的转动轴相互垂直，反射面严格位于4f系统的共轭面上，以保证环状TIRF照明光斑维持一个完美的圆形。

本实用新型的有益效果如下：

(1)本实用新型能够在EPI、HILO和TIRF之间快速切换显微成像模式；

(2)环状TIRF的实现提高了成像质量，也弥补了不同波长激发造成的入射深度的差异，光源均一化有利于观察细胞内部的微小结构；

(3)成像速度快，环状TIRF扫描形成时间在10ms左右，不影响细胞观察；

(4)对实验条件无特殊要求，普适性好，操作方便。