[发明专利]一种抗性愈伤组织的筛选方法

说明书

本申请公开了一种抗性愈伤组织的筛选方法，包括以下步骤：挑取介导转化后的愈伤组织于培养皿中，愈伤组织表面若无菌体存在则可不用无菌水进行冲洗，若有菌体存在则用无菌水于120rpm条件下冲洗3‑5次，最后一次用含500mg/L Cef的无菌水静置1h。置于无菌滤纸上干燥30min，直至愈伤组织表面无可见农杆菌存在。本发明方法通过改变培养温度和培养时间，缩短农杆菌介导转化水稻的进程，并提高了水稻愈伤组织的诱导率和转化率。

技术领域

本发明分子生物学组织培养和转基因技术交叉技术领域，特别涉及一 种抗性愈伤组织的筛选方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)不仅是主要的粮食作物也是单子叶植物基础研 究的模式植物。随着世界人口的不断增长以及人们生活水平的提高，从而 对水稻产量和品质提出了更高的要求。传统育种具有育种年限长，需连续 自交才能选育出需要的优良性状已经很难满足需求，通过现代生物技术与 传统育种技术相结合来提高水稻的产量和质量已成为今后主要的发展趋 势。

随着分子生物学的发展，越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离 出来，如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因，参与对病原物 识别的基因等，要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位，就要构建 转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物， 来明确该基因在植物抗病中的作用。

水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转 化法。DNA直接导入法主要包括PEG(polyethylene glycol)介导的转化 法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。其中PEG法、电 穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很 大限制。

基因枪法优点是受体广泛，不受寄主范围的限制，转化率较高，但和 其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点：外源DNA的整合方式复杂， 常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能 太大(上限是16-20kb)，转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。

同DNA直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培

目前，在现有技术水稻愈伤组织诱导培养中，其培养温度为26℃培养 9-12天，农杆菌介导转化水稻共培养的时间为2天，在愈伤组织诱导培养 阶段采取低温处理培养时间长，水稻愈伤组织的出愈率和愈伤组织质量较 差，愈伤组织的诱导率和转化率低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种农杆菌介导水稻遗传转 化方法。本发明方法通过改变培养温度和培养时间，缩短农杆菌介导转化 水稻的进程，并提高了水稻愈伤组织的诱导率和转化率。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种抗性愈伤组织的筛选方法， 包括以下步骤：挑取介导转化后的愈伤组织于培养皿中，愈伤组织表面若 无菌体存在则可不用无菌水进行冲洗，若有菌体存在则用无菌水于120rpm 条件下冲洗3-5次，最后一次用含500mg/LCef的无菌水静置1h。

进一步包括：置于无菌滤纸上干燥30min，直至愈伤组织表面无可见 农杆菌存在。

进一步包括：将愈伤组织转移至含Hyg 20-25mg/L和200-400mg/L Timentin的筛选培养基进行筛选抗性愈伤，28℃暗培养，15d筛选一次， 共筛选两次。

一种抗性愈伤组织的分化方法，包括以下步骤：从筛选后长出的抗性 愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有Hyg 20-25mg/L和 200-400mg/L Timentin的分化培养基上，先暗培养7d，然后转至15h/d光 照条件下培养，经过15d长出新的抗性愈伤并且出现绿点。

进一步包括：挑选乳黄色致密有绿点的抗性愈伤组织转接于新的分化 培养基上，于25d后进一步分化出小苗。