[发明专利]抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体及应用

说明书

本发明公开了一种抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体及应用。本发明以IgG抗体的CH2片段为对象，在已有的改造骨架m01s的基础上，预测易聚集区，进行进一步优化，得到新骨架m01sm1。m01sm1相对于突变体m01s，其稳定性更好，有利于开发更稳定的C‑型单域抗体，可降低单克隆抗体或者Fc融合蛋白的生产、纯化、保存成本，其抗聚集能力更好，可降低因为蛋白的聚集而导致临床使用风险。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地指一种抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体及应用。

背景技术

抗体以其特异性强、灵敏度高，广泛应用于各个领域，尤其是生命科学研究和临床治疗如ELISA、Western blot、免疫荧光分析、疾病快速诊断以及作为生物制剂治疗各种疾病。因此，进入21世纪以来，人们也开始越来越关注治疗性抗体药物的研发与临床应用，这是因为它对人体毒副作用小、具有天然和高度特异性的疗效，并且创造出了巨大的社会效益和经济效益。同时，基于CH2片段开发的小型化抗体以其分子量相对较小而具有很好的组织渗透性，可以识别全长抗体难以识别的表位。

然而，以野生型CH2片段为骨架开发的抗体存在自身局限性，如如稳定性差、抗聚集能力弱，在其表达、纯化、贮存等过程中，会倾向于聚集或者降解。而蛋白聚集所导致的免疫原性，不仅降低了药效，同时也给临床应用带来很大的风险。因此，提高抗体热稳定性与抗聚集能力是该领域亟待解决的问题之一。

针对CH2的稳定性较弱的缺陷，有研究者通过引入一对二硫键得到一个CH2的突变体m01，相对CH2，其Tm值提高近20℃(Gong R,et al.,J Biol Chem.,2009)；通过截去CH2的N-端的七个处于无规则状态的氨基酸，得到一个截短的突变体CH2s，相对CH2，CH2s的抗聚集能力得到显著提高(Gong R,et al.,Mol Pharm.,2013)。将这两者结合之后得到一个新的突变体m01s(Gong R,et al.,J Biol Chem.,2011)，它的Tm值比CH2的Tm值高30℃，具有更好的可溶表达与蛋白酶抗性。更为重要的是，相对于CH2，m01s具有更好的依赖于pH的与人FcRn的结合能力，在不同动物模型中的血浆半衰期可达10小时左右，远远长于与其分子量相似的其它结构域(如VH的血浆半衰期仅有几分钟)(Gehlsen K,et al.,MAbs,2012)。因此，m01s可以作为一个理想的骨架用于抗体库的构建和筛选。

发明内容

本发明的目的在于提高IgG或者以CH2为骨架的小型化抗体抗聚集性，提供一种抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体及应用，在已有的改造骨架m01s的基础上，对其进行进一步优化，在保证其空间构象的同时，提高其抗聚集性。

为实现上述目的，本发明提供了一种抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体，命名为m01sm1，其氨基酸序列为Seq ID No.1。

可选地，所述抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体的编码基因序列为Seq IDNo.2。

本发明还揭示了上述抗聚集人源IgG抗体CH2结构域突变体在制备Fc融合蛋白中的应用以及在制备单克隆抗体中的应用。

本发明以IgG抗体的CH2片段为对象，在已有的改造骨架m01s的基础上，预测易聚集区，进行进一步优化，得到新骨架m01sm1。将该CH2骨架表达纯化之后，对其存在形式与分子结果进行了分子筛、圆二色谱分析，通过紫外分光光度计与荧光光谱仪测定其稳定性、抗聚集能力；随后，利用可识别CH2结构域的单抗Anti-CH2对其构象变化进行了分析，表明定向修饰改造后的CH2骨架空间构象变化后提高了其稳定性。新的CH2骨架在单克隆抗体、Fc融合蛋白或者直接以该骨架开发抗体的研发和临床使用上具有重要意义，包括提高其稳定性后有利于降低生产、纯化成本，有利于降低单抗聚集引发的免疫原性等。

本发明的有益效果：