[发明专利]TNFr与稳定性和抗聚集性增强的Fc片段融合蛋白及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地指一种TNFr与稳定性和抗聚集性增强的Fc片段融合蛋白及其制备方法。

背景技术

人肿瘤坏死因子(TNF-α)是一种活化的单核/巨噬细胞产生的细胞因子，并具有多种生物学效应。TNF-α能够诱导肿瘤细胞坏死或凋亡，且同时是介导炎症反应的主要细胞因子。重组人II型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白(TNFr-Fc)是一种由美国FDA批准的，可用于治疗如类风湿性关节炎等自身免疫疾病的蛋白药物。Etanercept(Enbrel TM)是已经上市的商品化的TNFr-Fc融合蛋白，也是抗TNF最有效的药物之一，也是生物技术药物中销售非常高的产品。中国中信国建所生产的TNFr-Fc融合蛋白已生产上市，商品名为益赛普，用于治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎的骨和关节损伤。

然而，这些抗体药物以及Fc融合蛋白作为生物活性大分子，它也有自身的局限性，如稳定性差、抗聚集能力弱，在其表达、纯化、贮存等过程中，会倾向于聚集或者降解。而蛋白聚集所导致的免疫原性，不仅降低了药效，同时也给临床应用带来很大的风险。因此，提高抗体稳定性与抗聚集能力是该领域亟待解决的问题之一。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中Fc融合蛋白稳定性差、抗聚集能力弱的缺陷，提供一种TNFr与稳定性和抗聚集性增强的Fc片段融合蛋白及其制备方法与应用，与现有TNFr-Fc融合蛋白相比，它具有稳定性更好、更加抗聚集的特点，从而有助于提高TNFr-Fc的药效，减少由于不稳定或者容易聚集而带来的副作用。

为实现上述目的，本发明提供了一种TNFr与稳定性和抗聚集性增强的Fc片段融合蛋白，其氨基酸全长序列为Seq ID No.3，命名为TNFr-S23。

可选地，所述TNFr-S23的编码基因序列为Seq ID No.4。

本发明还提供了上述TNFr与稳定性和抗聚集性增强的Fc片段融合蛋白的制备方法，其步骤如下：

(1)获取人源IgG野生型Fc和TNFr的基因；

(2)设计引物将野生型Fc中的指定氨基酸碱基突变成编码半胱氨酸的碱基，扩增出得到突变型Fc；

(3)通过搭桥PCR的方法将TNFr与突变型Fc的基因进行融合得到完整的TNFr-S23基因；

(4)以TNFr-S23基因序列构建真核表达载体，转染哺乳动物细胞，进行真核表达，纯化得到目的蛋白。

本发明还揭示了上述TNFr与稳定性和抗聚集性增强的Fc片段融合蛋白，在制备治疗自身免疫疾病的药剂中的应用。

本发明是通过将TNFr-Fc融合蛋白的人源抗体IgG的Fc段的CH2和CH3结构域分别引入一对二硫键，进而提高分子的稳定性和抗聚集能力。

本发明的有益效果：

(1)相对于野生型的TNFr-Fc，其稳定性更好，可降低蛋白的生产、纯化、保存成本；

(2)相对于野生型的TNFr-Fc，其抗聚集能力更好，可降低因为蛋白的聚集而导致临床使用风险。

附图说明

图1为TNFr-Fc、TNFr-S23蛋白的表达纯化后蛋白免疫印迹检测图。

图2为TNFr-Fc、TNFr-S23蛋白的表达纯化后SDS电泳图。

图3为TNFr-Fc、TNFr-S23分子的存在形式分析图(单体、二聚体等)；其中A为益赛普，B为Etanercept，C为TNFr-Fc，D为TNFr-S23。

图4为TNFr-Fc、TNFr-S23蛋白在变性剂条件下的稳定性比较图。

图5为TNFr-Fc、TNFr-S23蛋白的抗聚集性比较图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：扩增TNFr-Fc、TNFr-S23片段基因

采取人源血样，用Trizol Reagent(Invitrogen公司)抽提细胞总RNA，得到的细胞总RNA溶解于50μL无RNA酶的水中。然后用M-MLV逆转录酶试剂盒(Promega公司)，采用随机引物，逆转录得到cDNA。

根据IgG的Fc的基因序列(GenBank:KJ905798.1)，分析其氨基酸序列，设计Fc基因的正、反向引物扩增目的片段：

正向引物

5-GAG CCC AAA TCT AGC GAC AAAACT CAC AC-3(1)