[发明专利]一种提高米曲霉脂肪酶异源表达的方法

权利要求书

1.一种提高米曲霉脂肪酶异源表达的方法，其特征在于所述方法是将米曲霉脂肪酶基因导入毕赤酵母中获得重组毕赤酵母基因工程菌，将重组酵母基因工程菌进行发酵培养，将发酵液分离提取，获得米曲霉脂肪酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述米曲霉脂肪酶基因核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)X-33。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述重组毕赤酵母基因工程菌的制备方法为：将米曲霉脂肪酶基因插入表达载体pPICZɑA，构建表达质粒AOL-pPICZɑA；将表达质粒AOL-pPICZɑA导入毕赤酵母中，通过抗性梯度筛选获得能够表达米曲霉脂肪酶基因的重组毕赤酵母基因工程菌。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述表达质粒AOL-pPICZɑA的构建是将米曲霉脂肪酶基因插入pPICZɑA载体EcoR I和Kpn酶切位点之间所得。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养方法为：将重组毕赤酵母基因工程菌接种至BMMY发酵培养基，在30℃，初始pH为6.0，200rpm条件下进行发酵培养，每隔24h补加体积终浓度为1.0％甲醇进行诱导，发酵培养结束后，将发酵液离心，收集上清液，得到含有米曲霉脂肪酶的粗酶液；所述BMMY发酵培养基质量终浓度组成为：酵母粉1％、蛋白胨2％、0.1mol/L pH6.0磷酸钾缓冲液、无氨基酵母氮源1.34％、生物素4×10^-5％、甲醇0.5％，溶剂为去离子水，pH为6.0。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述重组酵母基因工程菌在发酵培养前先进行活化和扩大培养，然后将扩大培养液以体积浓度1～2％的接种量接种至BMMY发酵培养基，所述活化培养为：将重组毕赤酵母基因工程菌接种至YPD培养基，在30℃培养1d，获得活化菌体；所述YPD培养基质量终浓度组成为：1％酵母粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖，溶剂为去离子水，pH值自然；所述扩大培养是将活化菌体接种至BMGY培养基，在30℃培养1d，获得扩大培养液；所述BMGY培养基质量终浓度组成为：酵母粉1％、蛋白胨2％、0.1mol/L pH6.0磷酸钾缓冲液、无氨基酵母氮源1.34％、生物素4×10^-5％、甘油1％，溶剂为去离子水，pH为6.0。