[发明专利]一种桔梗细胞的悬浮培养方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种桔梗细胞的悬浮培养方法。

(二)背景技术

桔梗(Platycodon grandiflorus(Jacq.)A.DC.)是桔梗科桔梗属多年生草本植物。在我国南北都有栽培分布。桔梗既是重要的观赏花卉，同时更是一种重要的药用植物，桔梗的叶、花、根均可入药，尤其根具有重要医药价值,其细胞组织内含有多种皂甙，迄今已分得18种三萜皂甙。研究表明，桔梗皂甙不但具有镇静、镇痛及解热等中枢抑制作用,而且具有抗炎及镇咳祛痰、扩张血管、降压、降血糖作用、抗溃疡作用。

目前桔梗主要采用种子繁殖，种子繁殖生长周期长，扦插繁殖又容易传播病毒，最重要的是受季节变化和耕地逐渐减少的影响，导致无法满足桔梗医药的市场需求。由于人工种植桔梗存在上述问题，因此迫切需要找到一种能安全、快速而大量生产桔梗细胞培养物的途径和方法。而采用组织培养技术不仅能解决桔梗品种的繁殖变异问题，还可以通过细胞培养大量生产桔梗次生代谢产物。桔梗的悬浮细胞系的建立目前还未见报道，在工业生产中，通过桔梗细胞培养是获得桔梗细胞次生代谢药物和提取药理活性因子的有效途径之一，而且可研究桔梗生长发育及分化的机制、遗传变异规律，对桔梗的遗传育种具有特殊意义。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种桔梗细胞的悬浮培养方法。

本发明采用的技术方案是：

一种桔梗细胞的悬浮培养方法，所述方法按如下步骤进行：

(1)无菌外植体的获取：选取生长健康、无病虫害的桔梗腋芽作为外植体，用自来水冲洗30～60min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇2～5min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70～75％乙醇水溶液浸泡30～60s，然后用质量浓度0.1％HgCl₂消毒液浸泡8～12min，再用无菌水冲洗3～5遍，在灭菌的滤纸上吸干水分；

(2)桔梗愈伤组织的诱导培养：将消毒后的腋芽接入愈伤组织诱导培养基中，先在23～28℃下，暗培养10～15天，然后每天光照8～12小时、光照强度为1000～1500lx的条件下进行培养，所述的愈伤组织诱导培养基为添加6-BA(即6-苄氨基腺嘌呤)0.2～1.5mg/L、2，4-D(即2,4-二氯苯氧基乙酸)1.0～3.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.0g/L的MS固体基本培养基,培养基的pH值为5.8；

(3)细胞的预培养：将步骤(2)中获得的无褐化的黄白色愈伤组织转接入预培养液体培养基中进行5～9天的预培养，所述的预培养液体培养基为添加6-BA 0.1～1.0mg/L、2，4-D 1.0～4.0mg/L、蔗糖30g/L的MS液体基本培养基,培养基的pH值为5.8；

(4)细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的桔梗单个细胞或疏松细胞小聚集体，以20～50g/L的接种量转接到细胞悬浮培养基中，所述细胞悬浮培养基为添加6-BA 0.1～1.0mg/L、2，4-D 1.0～3.0mg/L、酸水解酪蛋白0.2～0.8g/L、蔗糖30g/L的MS液体培养基,培养基的pH值为5.8；

(5)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了15～25天进行第一次继代培养，以后每隔15～25天继代一次；

(6)细胞增殖生长计算：取继代培养的细胞在4000r/min的离心机上离心10min后，倒掉上清液进行称重，即为鲜重；

细胞增殖倍数＝(收获量鲜重—接种量鲜重)/接种量鲜重；

细胞的生长速率(即每升培养液中每天生长量)＝(收获鲜重—接种量鲜重)/培养天数。

上述(3)、(4)、(5)步骤中桔梗细胞的培养条件均为温度23～28℃，pH值5.8，每天光照6～12小时，光照强度为1000～1500lx，摇床转速为120r/min。

进一步，步骤(2)所述愈伤组织诱导培养基为添加6-BA 1.0mg/L、2，4-D 1.5mg/L的MS固体基本培养基。

进一步，步骤(3)所述桔梗细胞的预培养液体培养基为添加6-BA0.5mg/L、2、4-D 2.0mg/L的MS液体基本培养基，预培养时间为7天。

进一步，步骤(4)所述桔梗细胞悬浮培养基为添加6-BA0.5mg/L、2，4-D 2.0mg/L、酸水解酪蛋白0.6g/L的MS液体基本培养基,pH值为5.8、蔗糖30g/L。

进一步，步骤(4)所述桔梗细胞悬浮培养基的细胞团接种量是30g/L。