[发明专利]一种猪全基因组sgRNA文库及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种猪全基因组sgRNA文库，其特征在于，所述文库包括猪(Sus scrofus)全基因组中的20438个基因的sgRNA；

所述sgRNA的获取过程为：首先在靶序列上获取候选sgRNA，然后对候选sgRNA进行脱靶分析并打分，最后根据打分结果对sgRNA过滤。

2.根据权利要求1所述的sgRNA文库，其特征在于，所述候选sgRNA的筛选标准包括20％-80％的GC含量；

优选地，所述候选sgRNA的筛选标准包括40％-70％的GC含量；

优选地，所述候选sgRNA的筛选标准还包括19-21nt的长度。

3.根据权利要求1或2所述的sgRNA文库，其特征在于，所述sgRNA的过滤标准包括选择靠近5’端的sgRNA；

优选地，所述sgRNA的过滤标准包括每个CDS片段的sgRNA数量不超过2条。

4.一种如权利要求1-3中任一项所述的猪全基因组sgRNA文库用于构建基于敲除突变体文库和/或基于敲除动物模型。

5.一种猪全基因组sgRNA文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)靶序列选择：从数据库中下载基因组序列和注释文件，选取具有5’20_nt+NGG-3’的序列特征的位点并移除跨越外显子区域的序列作为输入靶序列；

(2)sgRNA设计：根据GC含量为20％-80％和长度为19-21nt筛选候选sgRNA，并进行全基因组序列比对，并根据指定允许的错配数进行脱靶率评估并分级；

(3)sgRNA过滤：将评估并分级后的sgRNA根据以下标准进行筛选：选择靠近5’端的sgRNA和每个CDS片段的sgRNA数量不超过2条。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述靶序列的选择标准包括蛋白质编码基因选择CDS区域作为靶序列；

优选地，步骤(2)所述筛选依据还包括PAM序列和单双链模式。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述允许的错配数为0-5个，优选为5个；

优选地，步骤(2)所述sgRNA设计的脱靶率评估标准为：

1)将能够精确比对到基因组中多个位点的sgRNA过滤掉；

2)只比对到基因组中该sgRNA对应位置的sgRNA为Best；

3)对于其他的sgRNA根据错配位置从5’->3’罚分逐渐递减，再结合错配数进行综合打分，罚分越高风险越高。

8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述分级的级别包括：最优、低风险、风险适中和高风险四个级别。

9.根据权利要求5-8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述筛选的标准还包括：每个靶序列选择不大于6条的sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置、GC含量在20％-80％中的任意一种或至少两种的组合，优选为每个靶序列选择不大于6条的sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置、GC含量在20％-80％的组合。

10.根据权利要求5-9中任一项所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)靶序列选择：从数据库中下载基因组序列和注释文件，选取具有5’-20_nt+NGG-3’的序列特征的位点并移除跨越外显子区域的序列作为输入靶序列；

其中，蛋白质编码基因选择CDS区域作为靶序列；

(2)sgRNA设计：根据PAM序列、单双链模式、GC含量为20％-80％和长度为19-21nt筛选候选sgRNA，并进行全基因组序列比对并根据指定0-5个的错配数进行脱靶率评估并分为最优、低风险、风险适中和高风险四个级别；

其中，脱靶率评估的标准为

1)将能够精确比对到基因组中多个位点的sgRNA过滤掉；

2)只比对到基因组中该sgRNA对应位置的sgRNA为Best；

3)对于其他的sgRNA根据错配位置从5’->3’罚分逐渐递减，再结合错配数进行综合打分，罚分越高风险越高；

(3)sgRNA过滤：将评估并分级后的sgRNA根据以下标准进行筛选：选择靠近5’端的sgRNA、每个CDS片段的sgRNA数量不超过2条、每个靶序列选择不大于6条的sgRNA、只保留级别为最优和低风险的sgRNA、确保选择的sgRNA尽可能覆盖基因的不同转录本、每个基因的多个sgRNA尽量靶定到基因的不同位置和GC含量在20％-80％。