[发明专利]用于检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性的试剂盒

说明书

本发明提供一种用于检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性的试剂盒。该试剂盒中包括引物组合，所述引物组合为引物组I、引物组II、和/或引物组III；引物组I由Tub‑F3、Tub‑B3、Tub‑FIP‑E198A和Tub‑BIP组成；引物组II由Tub‑F3、Tub‑B3、Tub‑FIP‑E198V和Tub‑BIP组成；引物组III由Tub‑F3、Tub‑B3、Tub‑FIP‑E198K和Tub‑BIP组成。本发明提供了一种基于分子水平的方便、灵敏、结果判断直观且可在田间操作的灰葡萄孢抗药性检测方法，可以保证基层技术员在田间，两小时内获得客观、可靠的检测结果。

技术领域

本发明涉及植物病原菌抗药性检测领域，更具体地，涉及用于检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性的引物组合及其试剂盒。

背景技术

由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是果蔬上一种非常普遍的病害，且危害十分严重，给果蔬生产造成了巨大的损失。目前防治该病害仍然主要依赖于杀菌剂。苯并咪唑类杀菌剂是生产上现在使用较多的一类杀菌剂。但由于其大量使用，灰葡萄孢已对其产生了抗药性，而该药的防治效果也随之大幅度下降。对抗性菌株进行研究发现，抗性菌株的β-微管蛋白基因的第198位密码子发生了点突变，使原先的谷氨酸被丙氨酸、缬氨酸或赖氨酸替代(E198A/V/K)。

若在喷药前就能明确田间是否已产生了抗性菌株，就可以准确制定杀菌剂喷施计划，以提高防治效果。目前比较常用的检测方法包括两种，即以菌丝生长抑制为基础的传统的菌落直径法和基于目标基因的PCR技术。传统的菌落直径法需要采集田间菌株，进行单孢分离，然后在添加一系列浓度的杀菌剂培养基上进行培养，检测杀菌剂对菌丝生长的抑制效应。抗性菌株的β-微管蛋白基因的E198A/V/K点突变是田间大多数病原菌对苯并咪唑类杀菌剂产生抗药性的原因。有研究在此基础上设计相应引物，通过扩增片段长度或者测序结果可以对灰葡萄孢的抗药性进行定性检测。

传统的菌丝对药剂的敏感性测定方法通常需要几周时间，工作量大，测定样本数量有限，要求严格的无菌操作，难以在早期就发现抗药性菌株的存在。基于PCR技术的检测方法，所需仪器价格昂贵，对操作人员的技术要求较高，不适合在田间或者地方市县等农业部门推广。

发明内容

为了克服现有技术检测周期长，工作量大，需要无菌条件，及PCR技术对仪器和人员技术要求高的缺陷，本发明的第一个目的，提供了一种用于检测灰葡萄孢对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性的引物组合，所述引物组合为引物组I、引物组II、和/或引物组III。

其中，所述引物组I由外引物和内引物组成，所述外引物由Tub-F3和Tub-B3组成，所述内引物由Tub-FIP-E198A和Tub-BIP组成，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。

外引物：

Tub-F3：GCAACTCTCTCTGTCCATCAA，如SEQ ID NO.1所示；

Tub-B3：CCAACTTTCGGAGATCTGAGT，如SEQ ID NO.2所示。

内引物：

Tub-FIP-E198A：

GGTTGCTGAGCTTCAAGGTTCTCACAATTGGTTGAGAACTCTGATGC，如SEQ ID NO.3所示；

Tub-BIP：

TCTTAACCACTTGGTTTCCGCCG-AAGTTGACCAGGGAAACGG，如SEQ ID NO.4所示。

其中，所述引物组II由外引物和内引物组成，所述外引物由Tub-F3和Tub-B3组成，所述内引物由Tub-FIP-E198V和Tub-BIP组成，所述Tub-FIP-E198V的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。