[发明专利]大肠埃希氏菌O157:H7干粉化LAMP快速检测试剂盒

说明书

本发明公开了大肠埃希氏菌O157:H7干粉化LAMP快速检测试剂盒，该试剂盒由干粉化检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、封闭液、显色液和裂解液组成，以上7种试剂分别置于容器中。应用于本试剂盒中的引物对应大肠埃希氏菌O157:H7特异性基因序列的8个区段，6条引物，并且通过加入显色液，阴阳性显色差异明显，具有特异性强、灵敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，适合于食品安全和医药卫生领域中的大肠埃希氏菌O157:H7快速检测。另外，本发明为干粉化的检测试剂，便于常温运输，且使用简单、快捷，无需专门仪器，降低成本并拓宽产品应用范围，更适用于现场及偏远地区基层对大肠埃希氏菌O157：H7的快速检测，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及微生物分子生物学检测试剂，具体涉及一种基于LAMP技术的干粉化大肠埃希氏菌O157:H7核酸快速检测试剂盒。

背景技术

大肠埃希氏菌(Escherichia coli)O157:H7是肠埃希氏菌中血清型毒力较强的菌种代表，引发以腹泻为主的动物源性传染病。大肠埃希氏菌O157:H7传播途径众多，包括食源性传播、水源性传播以及人畜接触传播等，其中以食源性传播更为普遍。近年来，我国大多数地区均又出现大肠埃希氏菌O157:H7感染疫情，一般为患病者进食被该致病菌污染的食物所致，并且表现出明显的季节性暴发，多集中在7～9月。大肠埃希氏菌O157:H7可感染所有年龄阶段的人群，尤以儿童和老人发病率较高，并且会引发多种严重的并发症，如溶血性尿毒综合征(HUS)和血栓形成性血小板减少性紫癫(TTP)，具有毒力强、病死率高等特点。但截止目前，尚未发现有预防大肠埃希氏菌O157:H7感染的疫苗，而有关该菌感染疫情的控制多集中在对食品安全卫生领域的早期检测、预防方面，因此如何快速、准确地鉴定出大肠埃希氏菌O157:H7具有重要的意义。当前已建立了多种大肠埃希氏菌O157:H7检测方法，主要包括采用传统培养基法(病原微生物分离鉴定、形态学鉴定及自动化鉴定方法)、酶联免疫技术、核酸探针技术、核酸扩增(PCR)技术等，但这些方法表现出检测周期长、操作复杂、仪器昂贵、成本高等不足，并且多局限在实验室检测，难以满足在基层现场的快速检测需求。

LAMP技术是由Notomi等人于2000年开发的一种新型的体外恒温扩增特异核酸片段的技术。该技术利用两对特殊引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶。使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在恒温条件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应，与常规PCR相比，无需反复变温、电泳判读等过程，在灵敏度、特异性和检测范围等技术指标上能媲美甚至高于PCR技术，而不依赖专门的仪器可以实现现场的快速检测，其成本远低于荧光定量PCR。而在实际的应用中，如果在非实验室的条件下利用LAMP技术进行快速检测，检测前都要配制相应的反应体系溶液，容易导致由于多次操作引起的误差，且易造成实验区间的交叉污染，检测所需的部分试剂需要冷冻储存，不适合高温长途运输，尤其是Bst DNA聚合酶，需要在-20℃条件下保存，不宜反复冻融，以免影响酶活，因此会增加试剂的运输成本。目前该检测方法尚未在食品安全、医药卫生等领域推广开来，且作为非标方法，目前已有的LAMP产品仅仅针对检测流程，涉及到样品前处理的方法和方式均无提及，加之市场上基于LAMP技术的大肠埃希氏菌O157:H7快速检测试剂盒较少，且能用于常温运输的干粉型同类产品尚未出现。

发明内容

本发明的目的在于针对现有大肠埃希氏菌O157:H7的传统致病微生物检测技术以及其相关产品制备工艺的不足，提供一种基于LAMP技术可常温运输的干粉化大肠埃希氏菌O157:H7快速检测试剂盒以及其制备使用方法。该试剂盒和使用方法涵盖从取样到检测的整体解决方案，可满足食品药品企业生产、流通中各个环节的快速检测的需求。

本发明所采取的技术方案是：

一种大肠埃希氏菌O157:H7的LAMP引物组，包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB，其序列如下：

大肠埃希氏菌O157:H7-F3：gctgtaaggcctattcgttcact