[发明专利]一种发酵生产重组胰高血糖素样肽-1蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种发酵生产重组胰高血糖素样肽‑1蛋白的方法，其特征在于，包括下列步骤：将含有编码重组胰高血糖素样肽‑1蛋白的核酸序列的基因工程菌用低磷酸盐培养基进行培养，控制培养阶段pH值和溶氧量，发酵结束后，离心去除菌体，经过纯化上清液得到所述重组胰高血糖素样肽‑1蛋白。本发明的方法能够高纯度、稳定分泌表达的GLP‑1，简化分离纯化工艺。

技术领域

本发明属于多肽技术领域，具体涉及一种发酵生产重组胰高血糖素样肽-1(GLP-1)蛋白的方法。

背景技术

全球糖尿病发病率正处于快速增长期，根据国际糖尿病联盟(IDF)最新的公布的第七版糖尿病数据显示，2015年全球糖尿病患者人数4.15亿，患病率8.8％。全球糖尿病患病率呈快速上升趋势，预计2040年糖尿病患者数将达6.42亿，患病率将上升至10.4％。中国糖尿病患者数2015年达1.096亿，居全球首位，预计到2040年中国糖尿病患者数将达1.507亿。糖尿病常引起严重并发症，如血管病变、视网膜病、肾病和外周神经病变等传统并发症。

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由肠壁L-细胞分泌的激素，其作用包括刺激葡萄糖依赖性胰岛素分泌，促进胰岛素生物合成，降低血糖，保护胰岛B细胞，改善2型糖尿病的症状。此外，近年发现它还能促进神经细胞的增殖和神经发生，抑制神经细胞凋亡。

据报导，目前使用基因工程表达GLP-1以融合蛋白表达为主，其工艺需要对大肠杆菌进行破碎，纯化后期需要使用酶切割，切割后再次纯化，酶切割对蛋白是否有影响，其成本昂贵，大大限制了GLP-1的产业化。因此，寻求一种更加高效和成本低的生产GLP-1的方法是非常有意义的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种发酵生产重组胰高血糖素样肽-1蛋白的方法，其能够高纯度、稳定地分泌表达GLP-1。

本发明所采取的技术方案是：

一种发酵生产重组胰高血糖素样肽-1蛋白的方法，其包括下列步骤：将含有编码重组胰高血糖素样肽-1蛋白的核酸序列的基因工程菌用低磷酸盐培养基进行培养，控制培养阶段pH值和溶氧量，发酵结束后，离心去除菌体，经过纯化上清液得到所述重组胰高血糖素样肽-1蛋白。

根据本发明的方法，所述编码重组胰高血糖素样肽-1蛋白的核酸序列如SEQ IDNO:1所示。

根据本发明的方法，所述基因工程菌包含表达载体phoA，所述表达载体phoA中插入有所述编码重组胰高血糖素样肽-1蛋白的核酸序列。优选的，周质分泌信号肽为pelB、phoA、ompA、ompF、ompT、lamB、SPA、StII、MalE、DsbA、TorA或HlyA中的一种。优选地，表达载体phoA中还含有STII信号肽序列。phoA为大肠杆菌碱性磷酸酶PhoA基因启动子，可以利用低磷诱导表达。相反，其他的一些启动子多是由IPTG诱导的，容易产生不溶的包涵体，同时诱导剂IPTG费用高。

根据本发明的方法，所述基因工程菌为大肠杆菌YK537。

根据本发明的方法，所述基因工程菌的构建步骤如下：

步骤1.合成重组胰高血糖素样肽-1基因的核酸序列，在该基因的5’端引入NheI酶切位点及在3’端引入BamHI酶切位点；

步骤2.构建表达载体：用NheI和BamHI双酶切分别处理所述步骤1合成的基因和表达载体phoA，37℃酶切2小时回收相应的片段用T4DNA连接酶在16℃连接过夜；连接产物转化进入大肠杆菌，在含有l00ug/mL氨苄青霉素的LB平板上挑选阳性克隆，从而构建表达载体；

步骤3.将所述步骤2构建好的表达载体转化到大肠杆菌YK537中。

优选地，所述步骤1中合成所述核酸序列的引物如下：