[发明专利]一种阪崎克罗诺杆菌快速检测试剂盒

权利要求书

1.一种阪崎克罗诺杆菌快速LAMP引物组，其特征在于：外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB的序列如下：

阪崎克罗诺杆菌-F3：tgcgtgctacagcggctatg

阪崎克罗诺杆菌-B3：gtgcgatgtcgatcattcact

阪崎克罗诺杆菌-FIP：atgcgtgcagctccgtgtagtgcgtgcagctgctttgtcact

阪崎克罗诺杆菌-BIP：cgtgcgatcgtcgtggcctgcgtcgtcgtagctgaacgcat

阪崎克罗诺杆菌-LF：gtcgtcgacggcgtcgagtcga

阪崎克罗诺杆菌-LB：atgcgatgctgggcagtcgtgaa。

2.一种阪崎克罗诺杆菌快速LAMP检测试剂盒，其特征在于：其LAMP引物组如权利要求1所示。

3.根据权利要求2所述的一种阪崎克罗诺杆菌快速LAMP检测试剂盒，其特征在于：检测试剂盒包括干粉化的检测试剂、复溶液、阳性对照干粉、阴性对照干粉、显色液、裂解液和封闭液。

4.根据权利要求3所述的一种阪崎克罗诺杆菌快速LAMP检测试剂盒，其特征在于：干粉化的检测试剂冻干前含有0.9～1.6mmol/L dNTPs、0.3～0.4U/μLBst DNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及含3％～6％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白的冻干复合保护剂，余量为无菌超纯水。

5.根据权利要求3所述的一种阪崎克罗诺杆菌快速LAMP检测试剂盒，其特征在于：复溶液含有2～9mmol/L MgSO₄、8～12mmol/L KCl、15～20mmol/L Tris-HCl、8～12mmol/L(NH₄)₂SO₄、0.1～0.3％Triton X-100以及0.5～1.5mol/L甜菜碱。

6.根据权利要求3所述的一种阪崎克罗诺杆菌快速LAMP检测试剂盒，其特征在于：显色液由0.3～1.5mmol/L的钙黄绿素和2.4～7.2mmol/L的MnCl₂按照混合得到，钙黄绿素的终浓度为15～75μmol/L，MnCl₂的终浓度为120～360μmol/L。

7.根据权利要求3所述的一种阪崎克罗诺杆菌快速LAMP检测试剂盒，其特征在于：裂解液含有：10～20mmol/L Tris-HCl pH 8.3、1mmol/L EDTA、0.3～1％SDS。

8.根据权利要求3所述的一种阪崎克罗诺杆菌快速LAMP检测试剂盒，其特征在于：封闭液为无菌石蜡油。

9.根据权利要求3所述的一种阪崎克罗诺杆菌快速LAMP检测试剂盒，其特征在于：阳性对照为提纯的阪崎克罗诺杆菌基因组DNA冻干粉，阴性对照为提纯的非阪崎克罗诺杆菌基因组DNA冻干粉。

10.根据权利要求3所述的一种阪崎克罗诺杆菌快速LAMP检测试剂盒，其特征在于：使用方法包括如下步骤：

(1)参照GB/T4789.40-2016《食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》，取检样100g(mL)置灭菌锥形瓶中，加入900mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水，36℃±1℃增菌培养10h±2h；

(2)取以上增菌液1～2mL经6000r/min离心，去上清；

(3)分别向(2)中离心得到沉淀中加入裂解液，充分悬浮，水浴或者金属浴99℃热裂解10min，裂解结束后12000r/min离心15min，上清即为待检样品粗提核酸；

(4)取冻干粉管，向冻干粉管内加入复溶液，待冻干粉充分溶解后，将待检测的样品核酸加入反应管中，对照管分别加入经无菌超纯水溶解的阪崎克罗诺杆菌基因组DNA作为阳性对照，以无菌超纯水溶解的非阪崎克罗诺杆菌基因组DNA作为阴性对照，后按照一定比例加入显色液，充分混匀后加入封闭液，设置63℃恒温反应；

(5)反应后结果判读：反应结束后，建议在自然光线充足的环境条件下将样品置于白色背景下观察结果，阴性对照反应后呈淡橙色，阳性对照反应后呈荧光绿，待测样品反应管以此作为对照进行判读，若阴阳对照反应管任一结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。